Etablere linjer Overexpressing DR3 å vurdere apoptotisk svaret anti-mitotisk Therapeutics
Summary
Stabil celle linjen overexpressing en genet av interesse å studere gen funksjon kan gjøres av stabil transfection-plukking enkelt kloner etter transfecting dem via retroviral infeksjon. Her viser vi at HT29-DR3 cellelinjer generert på denne måten belyse mekanismer som død reseptor 3 (DR3) bidrar til antimitotics-indusert apoptose.
Abstract
Studere funksjonen til en genet av interesse kan oppnås ved å manipulere nivået av uttrykk, for eksempel redusere sitt uttrykk med knockdown linjer eller øke sitt uttrykk med overuttrykte linjer. Forbigående og stabil transfection er to metoder som ofte brukes for eksogene genuttrykk. Forbigående hva er bare nyttig for kortsiktige uttrykk, mens stabil transfection gir eksogene gener å bli integrert i vert celle genomet der det vil være kontinuerlig uttrykt. Som et resultat, er stabil transfection vanligvis ansatt for forskning i langsiktig genetisk regulering. Her beskriver vi en enkel protokoll for å generere en stabil cellen linje overexpressing merket død reseptor 3 (DR3) for utforske DR3 funksjon. Vi plukket enkelt kloner etter en retroviral infeksjon for å opprettholde homogenitet og renhet av de stabile linjene. De stabile cellelinjer generert ved hjelp av denne protokollen gjengi DR3 dårlig HT29 celler følsom for antimitotic stoffene, dermed gjenoppbygge apoptotisk svaret i HT29 celler. Videre flagg koden på DR3 kompenserer for utilgjengelighet av god DR3 antistoffer og muliggjør biokjemiske studiet av molekylære mekanismen som antimitotic agenter forårsake apoptose.
Introduction
Heterologous genuttrykk er ofte ansatt å studere funksjonen av gener av interesse. To metoder, forbigående og stabil transfection, prevalently brukes i celler og molekylærbiologi å sette inn et segment av DNA eller RNA i verten celle1,2. Transiently transfekterte DNA eller RNA kan ikke videreformidles til datter celler, så genetisk endring bare beholdes i en kort tidsperiode. På den annen side, i stabilt transfekterte celler, er eksogene gener integrert i vert celle genomet, opprettholde sitt uttrykk i cellen linje. Dermed er stabil transfection en metode som er vanligvis reservert for forskning på langsiktige genetisk regulering. Stabil celle linjen kan også være transplantert som xenografts til musen modeller in vivo studere3. Stabil transfection kan deles inn i to kategorier: virus- og nonviral. Sammenlignet med nonviral hva, kan virusinfeksjon overføre gener til et bredere utvalg av menneskelige celler med en høyere effektivitet4,5,6,7. Videre tilbyr en stabil cellen linje fra en enkel klone fordelen av homogenitet og klonal renhet.
Ukontrollert cellevekst og deling er de mest særtrekk av kreft. I kliniske innstillinger er antimitotic agenter de primære behandlingene for mange typer av svulster8. Men ikke kan noen betydelige begrensninger av antimitotic agenter ignoreres. Først disse chemotherapies også kan drepe normale celler med uønsket cancerous celler, og dermed kan føre til alvorlige bivirkninger8. Andre, antitubulin narkotika er ikke effektiv mot alle typer av svulster, til tross for tubulin’s allestedsnærværende uttrykk i en rekke forskjellige vev som en cellen cytoskjelett proteiner9,10. Det er uklart hvorfor antitubulin agenter viste lovende effekt mot eggstokkene, lunge og Hematologisk kreft i klinisk behandling, men ikke i nyre, kolon eller pancreatic kreft11. Til slutt, selv pasienter med samme type svulst kan svare på antimitotics annerledes på en uforutsigbar måte. Det kan være en nøkkel effektor molekyl som påvirker følsomheten pasienter antimitotic agenter, som resulterer i ulike resultatene sett i klinisk behandling12. Dermed bør potensielle differensial problemområdene av pasienter til antimitotic behandling tas i betraktning for å optimalisere terapeutisk intervensjon13.
En høy gjennomstrømming hele-genome siRNA biblioteket skjermen vist at DR3 knockdown kan gjengi følsom celler motstandsdyktig mot antimitotic narkotika, implicating en rolle for DR3 i kjemoterapi-indusert apoptose14. Som medlem av tumor nekrose faktor reseptor (TNFR) gruppe, har DR3 blitt rapportert å megle celle apoptose i ulike systemer15,16,17,18. Derfor begynte vi for å etablere stabil linjer overexpressing DR3 for å studere molekylære mekanismer som antimitotic narkotika indusere apoptose. En riktig celle modell for å studere DR3 overuttrykte kan gis av menneskelig kolon kreft celle HT29, som ble funnet for å være DR3-mangelfull. I tillegg i klinikken, kolon kreft er ufølsom for antimitotic narkotika19.
I denne artikkelen beskriver vi en metode som tillater generering av en HT29-DR3 stabile cellen linje gjennom retroviral infeksjon. Videre viser vi hvordan å validere DR3 uttrykket i disse cellene med vestlige blotting og vurdere følsomheten til antimitotic agenter ved å bruke celle levedyktighet analysen og morfologiske observasjon. Cellene er forsterket fra enkelt kloner, og dermed har fordelen av en homogen genetisk bakgrunn. I tillegg tillatt flagg koden på DR3 for visualisering av mobilnettet DR3 mikroskopi og analyse av gene expression og protein samspillet av biokjemiske tilnærminger. Videre kan cellene xenografted i mus å analysere svulst progresjon svar på antimitotics i vivo14.
HT29-DR3 cellen systemet presenteres her tilbys et effektivt verktøy for å studere molekylære mekanismer av hvordan antimitotics drepe kreft celler14. Siden overuttrykte og pusse cellelinjer er vanlige verktøy for å studere gen funksjon, denne protokollen kan tilpasses enkelt andre gener severdigheter eller andre linjer, og dermed forvandlet til en mye brukt tilnærming.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å generere HT29-DR3 stabile linjer. HT29-DR3 celler gir en modell for å studere molekylære mekanismer som DR3 bidrar til apoptose indusert av antimitotic agenter. Denne tilnærmingen er allsidig og repeterbare. For å sikre suksess for prosedyren, må fire sentrale trinn av protokollen vurderes. Først, for å produsere en høy nok virus titer, det anbefales å utføre DNA transfection når Plat-A cellene på 80-90% samløpet. Andre bør viral suspensjon lagres på 4 ° …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd 53110000117 (til GW) og 043222019 (til X.W.) fra Tsinghuauniversitetet.
Materials
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | |||
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
Referências
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry – Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
