Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования
Summary
Расширенные микроскопов, которые позволяют быстро и с высоким разрешением изображений, изолированные плазматической мембраны и окружающие внутриклеточных объем, будет представлен. Интеграция спиннинг микроскопии флуоресцирования внутреннее отражение диска и всего в одной установки позволяет жить изображений эксперименты на приобретение высокой ставки до 3.5 сек на стек изображений.
Abstract
В живых клетках процессы, такие как формирование адгезии включать широкие структурные изменения в плазматической мембраны и внутренних ячейки. Для того, чтобы визуализировать эти весьма динамических событий, были объединены два взаимодополняющих световой микроскопии методы, которые позволяют быстро изображений живых образцов: спиннинг диск микроскопии (SD) для записи объем быстро и с высоким разрешением и полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) для точной локализации и визуализации плазматической мембраны. Всеобъемлющей и полной визуализации протокол будет показан для руководящих через пробоподготовки, калибровки микроскопа, формирования изображений и приобретения, что приводит к многоцветные SD-TIRF живой серии изображений с высоким разрешением пространственно временной. В макросе самостоятельной письменной предусмотрено все необходимое изображение после обработки шаги для создания многомерной живой визуализации наборов данных, т.е. регистрации и сочетание отдельных каналов, с открытым исходным кодом ImageJ. Изображения флуоресцентных белков во время посвящения и созревания адгезии комплексов, а также формирование актина цитоскелета сети, была использована как доказательство принципа для этот новаторский подход. Сочетание 3D микроскопия высокого разрешения и TIRF содержится подробное описание этих сложных процессов в пределах клеточной среды и, в то же время, точной локализации мембраны связанных молекул, обнаружены с высоким Соотношение сигнал фон.
Introduction
Наших дней, световой микроскопии методы обеспечения высокой/супер резолюции изображений в фиксированной и живой образец быстро развиваются. Суперразрешением методы, такие как стимулировали выбросов истощения (интереса), структурированные освещения микроскопии (SIM) и фото активации локализации микроскопии (PALM) или прямой стохастических оптических реконструкции микроскопии (буря), соответственно, являются коммерчески доступных и включение изображений внутриклеточных структур, показывая детали почти на молекулярном уровне1,2,3,4,5,6. Однако эти подходы имеют ограниченную применимость для живых изображений экспериментов, в которых большие объемы нужно быть визуализированы с несколько кадров в секунду скорость приобретения. Разновидности весьма динамических процессов, регулируется через плазматическую мембрану, например Эндо- / экзоцитоз, адгезии, миграции или сигнализации, происходят с высокой скоростью в пределах крупных сотовых томов. Недавно для того, чтобы заполнить этот пробел, интегрированный микроскопии техника была предлагаемая называется спиннинг диска TIRF (SD-TIRF)7. В деталях TIRF микроскопии позволяет специально изолировать и локализовать плазматической мембраны8,9, в то время как SD микроскопии является одним из наиболее чувствительных и быстро жить методы визуализации для визуализации и отслеживания внутриклеточных органелл в цитоплазме10,11. Сочетание обоих методы визуализации в одиночной установки уже был реализован в прошлом12,13, однако, Микроскоп, представленные здесь (рисунок 1) наконец отвечает критериям для выполнения живых изображений SD-TIRF эксперименты из вышеупомянутых процессов в 3 кадров в секунду скорость. Поскольку этот Микроскоп является коммерчески доступных, цель этой рукописи — описать в деталях и предоставлять открытым исходным кодом инструменты и протоколы для захвата изображений, регистрации и визуализации, связанный с SD-TIRF микроскопии.
Установки на основе инвертированным микроскопом, подключенных к блокам два сканирования через независимых порта – левый порт связан с блоком SD и задней порт блок сканера для TIRF и фото активации / отбеливания экспериментов. До 6 лазеры (405/445/488/515/561/640 Нм) могут быть использованы для возбуждения. Для возбуждения и обнаружения сигнала флуоресценции, либо 100 x / NA1.45 масло или 60 x / NA1.49 масло TIRF цели, соответственно, были заняты. Испускаемого света расколот дихроичное зеркало (561 Нм Лонг Пасс или 514 Нм Лонг pass) и фильтруется различными полосовые фильтры (55 Нм широкий центрированного 525 Нм, 54 Нм широкий центрированного 609 Нм для зеленой и красной флуоресценцией, соответственно) перед двумя EM-CCD камеры Эра. Пожалуйста, обратите внимание, что более подробные технические сведения об установке перечислены в Zobiak и др. 7. в TIRF конфигурации SD блок перемещается из света путь в течение около 0,5 s так, что же две камеры могут быть использованы для обнаружения, позволяя быстрое переключение между двумя визуализации формы, по сравнению с около 1 s, что было сообщено в прошлом13 . Эта функция позволяет одновременное приобретение двойного канала, таким образом 4 канала SD-TIRF изображений на ранее непревзойденную скорость и точность могут быть выполнены. Кроме того выравнивание между SD и TIRF образов ненужной. Выравнивание изображения между двумя камерами, однако, должна проверяться перед началом эксперимента и исправления в случае необходимости. В следующий протокол в макросе самостоятельной письменной ImageJ был реализован обычной регистрации коррекции. Кроме того макрос был главным образом позволяют одновременное визуализация SD – и TIRF наборов данных, несмотря на их различные размерности. Приобретение программного обеспечения, сама не представила эти возможности.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом документе было представлено первое успешное осуществление микроскопии SD и TIRF в конфигурации подходит для проведения живых клеток экспериментов и изображений, т.е. приобретение высокой ставки как 2 SD-TIRF стеки изображений в минуту в 3 различными этап позиции, соответствующие ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы сильно благодарю научного сообщества из университета медицинский центр Гамбург-Эппендорф за поддержку нас с образцами для оценки. А именно мы благодарим Sabine Windhorst для NIH3T3 клеток, Андреа Mordhorst для рекламы ЯФП-Vinculin и Рудольф Maren для ЗП-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Referências
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
