Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
Summary
Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu’à 3,5 s par la pile de l’image.
Abstract
Dans les cellules vivantes, les processus tels que la formation d’adhérences impliquent des changements structurels importants dans la membrane plasmique et l’intérieur de la cellule. Afin de visualiser ces événements très dynamiques, on a combiné les deux techniques de microscopie optique complémentaire permettant l’imagerie rapide des échantillons vivants : filature de la microscopie (SD) de disque pour l’enregistrement de volume rapide et haute résolution et de la réflexion totale interne microscopie de fluorescence (FRBR) pour la localisation précise et visualisation de la membrane plasmique. Un protocole d’imagerie complète et s’affichera pour les guider dans la préparation de l’échantillon, l’étalonnage de microscope, formation d’images et acquisition, résultant en une série d’imagerie live avec haute résolution spatio-temporelle du SD-FRBR multicolore. Toutes les étapes de post-traitement image nécessaire pour générer multidimensionnelle datasets imagerie direct, c’est-à-dire l’enregistrement et la combinaison des canaux individuels, sont fournis dans une macro autonome écrite pour le logiciel open source ImageJ. L’imagerie des protéines fluorescentes au cours de l’initiation et la maturation des complexes de l’adhérence, ainsi que la formation du réseau d’actine du cytosquelette, a été utilisé comme une preuve de principe pour cette approche originale. La combinaison de la microscopie 3D de haute résolution et de la FRBR a fourni une description détaillée de ces processus complexes dans l’environnement cellulaire et, en même temps, une localisation précise des molécules associées aux membranes détecté avec une haute rapport de signal-à-fond.
Introduction
Nos jours, les techniques de microscopie optique fournissant l’imagerie haute/super résolution en fixe et spécimen vivant sont développent rapidement. Techniques de super-résolution telles que stimulent d’émission microscopie d’illumination épuisement (STED), structuré (SIM) et la microscopie de photoactivation localisation (PALM) ou microscopie directes de reconstruction stochastique optique (STORM), respectivement, sont disponible dans le commerce et permettent l’imagerie des structures subcellulaires, montrant des détails presque à l’échelle moléculaire1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ont toujours limité applicabilité pour des expériences d’imagerie live dont grands volumes doivent être visualisés avec plusieurs frames par seconde vitesse d’acquisition. Variétés des processus hautement dynamiques régies par l’intermédiaire de la membrane plasmique, par exemple , endo- / exocytose, d’adhérence, de migration ou de signalisation, se déroulent à haute vitesse dans les grands volumes cellulaires. Récemment, afin de combler cette lacune, une technique de microscopie intégrée a été proposée filature appelé disque-FRBR (SD-FRBR)7. En détail, microscope TIRF permet spécifiquement isoler et localiser la membrane plasmique8,9, tandis que la microscopie SD est parmi les plus sensibles et rapide vivent des techniques d’imagerie pour la visualisation et le suivi des organites subcellulaires dans le cytoplasme10,11. La combinaison des deux techniques d’imagerie en une seule configuration ont déjà été réalisée dans les dernières12,13, cependant, le microscope présenté ici (Figure 1) enfin répond aux critères pour effectuer des expériences de SD-FRBR imageries live des processus susmentionnés à 3 images par seconde vitesse. Ce microscope étant disponible dans le commerce, l’objectif de ce manuscrit est de décrire dans le détail et offrir des outils open source et des protocoles d’acquisition d’images, enregistrement et visualisation associée à la microscopie SD-FRBR.
La configuration est basée sur un microscope inversé raccordé à balayage deux appareils via les ports indépendants – le port gauche est lié à l’unité de la SD et le port arrière pour unité scanner pour FRBR et photo-activation/blanchiment des expériences. Jusqu’à 6 lasers (405/445/488/515/561/640 nm) peut être utilisée pour l’excitation. Pour l’excitation et la détection du signal de fluorescence, soit un 100 x / NA1.45 huile ou x 60 / NA1.49 huile objectif FRBR, respectivement, ont été employées. La lumière émise est divisée par un miroir dichroïque (561 nm de long-pass ou 514 nm de long-pass) et filtrée par divers filtres passe-bande (55 nm de large centrée à 525 nm, 54 nm de large centrée à 609 nm pour la fluorescence verte et rouge, respectivement) placés devant les deux cam EM-CCD enchères électroniques inversées. Veuillez noter que des détails plus techniques sur le programme d’installation sont répertoriés dans Zobiak et al. 7. dans la configuration de la FRBR, l’unité de la SD est déplacée hors du trajet optique dans environ 0,5 s afin que les deux caméras mêmes peuvent être utilisés pour la détection, ce qui permet une commutation plus rapide entre les deux modalités d’imagerie comparées à environ 1 s qui a été rapporté dans le passé13 . Cette fonction permet l’acquisition simultanée de deux canaux, donc 4 canaux SD-FRBR imagerie à précédemment vitesse inégalée et exactitude peut être effectuée. Par ailleurs, l’alignement entre les images SD et FRBR est inutile. Alignement de l’image entre les deux caméras, toutefois, doit être vérifié avant de commencer l’expérience et corrigé si nécessaire. Dans le protocole suivant, une routine de correction d’enregistrement a été mis en œuvre dans une macro autonome écrite d’ImageJ. En outre, la macro a été principalement conçue pour permettre une visualisation simultanée de SD – et datasets FRBR malgré leur dimensionnalité différente. Le logiciel d’acquisition elle-même n’a pas fourni ces fonctionnalités.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le présent document a été présenté la première mise en œuvre réussie de la SD et TIRF microscopie dans une configuration adaptée pour réaliser des expériences d’imagerie de cellules vivantes, c’est-à-dire taux d’acquisition élevée tels que 2 cheminées d’image SD-FRBR / minute à 3 différents stade postes, correspondant à un total de 168 images (environ 3 images par seconde), ont été acquises. Les microscopes de SD-FRBR quelques qui ont été décrits précédemment…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions grandement les scientifiques de l’université médicale centre Hamburg-Eppendorf pour nous soutenir avec des échantillons pour évaluation. À savoir, nous remercions Sabine Windhorst de cellules NIH3T3, Andrea Mordhorst pour YFP-Vinculine et Maren Rudolph pour DP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Referências
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