Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco
Summary
Imaging di entrambi, l’isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L’integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un’unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.
Abstract
In cellule viventi, processi quali la formazione di aderenze coinvolgono vasti cambiamenti strutturali nella membrana plasmatica e l’interno delle cellule. Per visualizzare questi eventi altamente dinamici, sono stati combinati due tecniche di microscopia chiara complementari che permettono la formazione immagine veloce dei campioni dal vivo: filatura microscopia disco (SD) per la registrazione veloce e ad alta risoluzione volume e riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRF) per localizzazione precisa e la visualizzazione della membrana plasmatica. Verrà mostrato un protocollo di formazione immagine ampio e completo per guidare attraverso la preparazione del campione, taratura del microscopio, formazione dell’immagine e acquisizione, con conseguente serie di formazione immagine multicolore SD-TIRF dal vivo ad alta risoluzione spazio-temporale. Tutti i passaggi di post-elaborazione immagine necessaria per generare dataset multidimensionale in imaging dal vivo, cioè registrazione e combinazione dei singoli canali, sono forniti in una macro auto-scritta per il software open source ImageJ. L’imaging di proteine fluorescenti durante l’inizio e la maturazione dei complessi di adesione, così come la formazione della rete del citoscheletro di actina, è stato utilizzato come una prova di principio per questo nuovo approccio. La combinazione di microscopia 3D ad alta risoluzione e TIRF ha fornito una descrizione dettagliata di questi processi complessi all’interno dell’ambiente cellulare e, allo stesso tempo, precisa localizzazione delle molecole di membrana-collegato rilevato con un alto rapporto di segnale–fondo.
Introduction
Nostri giorni, tecniche di microscopia chiara fornendo alta/super risoluzione imaging in fissa ed esemplare vivente sono in rapida evoluzione. Tecniche di Super-risoluzione stimolato microscopia di emissione svuotamento (STED), strutturato illuminazione (SIM) e microscopia di localizzazione foto-attivazione (PALM) o microscopia diretta ricostruzione ottica stocastica (tempesta), rispettivamente, sono disponibili in commercio e permettono la formazione immagine di strutture subcellulari mostrano dettagli quasi su scala molecolare1,2,3,4,5,6. Tuttavia, questi approcci ancora limitata applicabilità per esperimenti di imaging dal vivo in cui grandi volumi devono essere visualizzate con più fotogrammi al secondo velocità di acquisizione. Varietà dei processi altamente dinamici regolamentati tramite la membrana del plasma, ad es. endo- / esocitosi, adesione, migrazione o segnalazione, si verificano con l’alta velocità all’interno di grandi volumi di cellulare. Recentemente, al fine di riempire questa lacuna, una tecnica di microscopia integrato era proposto chiamato filatura disco-TIRF (SD-TIRF)7. In dettaglio, la microscopia TIRF consente specificamente isolare e localizzare la membrana plasmatica8,9, mentre la microscopia SD è uno della più sensibile e veloce live tecniche di imaging per la visualizzazione e il monitoraggio di organelli sottocellulari nel citoplasma10,11. La combinazione di due tecniche di imaging in un unico setup è stata realizzata già nel passato12,13, tuttavia, il microscopio presentato qui (Figura 1) infine soddisfa i criteri per eseguire esperimenti di SD-TIRF imaging dal vivo dei suddetti processi a 3 fotogrammi al secondo di velocità. Poiché questo microscopio è commercialmente disponibile, l’obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere in dettaglio e fornire strumenti open source e protocolli per l’acquisizione delle immagini, registrazione e visualizzazione associata con microscopia di SD-TIRF.
Il programma di installazione si basa su un microscopio invertito a scansione due unità tramite porte indipendenti – la porta di sinistra è collegata all’unità SD e porta posteriore per unità scanner per TIRF e foto-attivazione /-candeggio esperimenti. Fino a 6 laser (405/445/488/515/561/640 nm) può essere utilizzato per l’eccitazione. Per il rilevamento del segnale di fluorescenza, sia una 100 x ed eccitazione / NA1.45 olio o x 60 / NA1.49 olio obiettivo TIRF, rispettivamente, sono stati impiegati. La luce emessa è divisa da uno specchio dicroico (561 nm long-pass o 514 nm long-pass) e filtrata dai vari filtri passa-banda (55 nm vasta centrata a 525 nm, 54 nm vasta centrata a 609 nm per fluorescenza verde e rosso, rispettivamente) posizionato davanti alla cam EM-CCD due ere. Siete pregati di notare che ulteriori dettagli tecnici sull’installazione sono elencati in Zobiak et al. 7. in configurazione TIRF, l’unità SD viene spostato fuori dal percorso della luce all’interno di circa 0,5 s affinché le stesse due telecamere possono essere utilizzate per il rilevamento, consentendo più veloce di commutazione tra le due modalità di imaging, rispetto ai circa 1 s è stato segnalato in passato13 . Questa funzionalità consente acquisizione simultanea dual channel, quindi 4 canali SD-TIRF imaging in precedenza Velocità ineguagliata e precisione possa essere eseguite. Inoltre, l’allineamento tra le immagini SD e TIRF è inutile. Allineamento dell’immagine tra le due fotocamere, tuttavia, deve essere controllato prima di iniziare l’esperimento ed eventualmente corretto. Nel seguente protocollo, una routine di correzione di registrazione è stata implementata in una macro di ImageJ auto-scritta. Inoltre, la macro è stata progettata principalmente per consentire una visualizzazione simultanea dei DataSet TIRF nonostante la loro diversa dimensionalità e SD. Il software di acquisizione in sé non ha fornito queste caratteristiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questa carta è stata presentata la prima implementazione di successo di SD e TIRF microscopia in una configurazione adatta per l’esecuzione di esperimenti imaging di cellule vive, cioè i tassi di acquisizione alta quali 2 serie di SD-TIRF immagini al minuto a 3 diversi stadi posizioni, corrispondenti a un totale di 168 fotogrammi (circa 3 fotogrammi al secondo), sono state acquisite. I microscopi di SD-TIRF pochi che erano precedentemente descritto12,13</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo enormemente la comunità scientifica della University Medical Center Hamburg-Eppendorf per averci sostenuto con campioni per la valutazione. Vale a dire, noi ringraziamo Sabine Windhorst per cellule NIH3T3, Andrea Mordhorst per YFP-vinculina e Maren Rudolph per RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Referências
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