تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع
Summary
مجهر متقدمة تسمح سريعة وعالية الدقة التصوير على حد سواء، من غشاء البلازما معزولة وحجم داخل الخلايا المحيطة بها، وسيقدم. يسمح إدماج الغزل القرص ومجموع التأمل الداخلي fluorescence مجهرية في الإعداد واحد يعيش تجارب التصوير في معدلات اقتناء عالية تصل إلى 3.5 ثانية لكل صورة المكدس.
Abstract
في الخلايا الحية، العمليات مثل تشكيل التصاق تنطوي على تغييرات هيكلية واسعة في غشاء البلازما وداخل الخلية. من أجل تصور هذه الأحداث ديناميكية للغاية، تم الجمع بين اثنين من التقنيات التكميلية الخفيفة الميكروسكوب أن السماح بتصوير سريع لعينات حية: الغزل القرص المجهري (SD) لتسجيل حجم سريعة وعالية الدقة والتأمل الداخلي الإجمالي الأسفار (TIRF) الفحص المجهري للترجمة الدقيقة والتصور من غشاء البلازما. سيظهر بروتوكول تصوير شاملة وكاملة لتوجيه من خلال إعداد العينة ومعايرة المجهر وتكوين الصور واقتناء، وأسفر متعدد الألوان SD-TIRF سلسلة التصوير العيش مع ارتفاع القرار الزمانية. وترد جميع خطوات تجهيز الصورة اللازمة لتوليد datasets التصوير حية متعددة الأبعاد، أي تسجيل ومجموعة من القنوات الفردية، في ماكرو الذاتي مكتوب لبرمجيات المصدر المفتوح إيماجيج. تصوير البروتينات الفلورية أثناء بدء تشغيل ونضوج التصاق المجمعات، وكذلك تشكيل شبكة cytoskeletal أكتين، استخدمت كدليل على المبدأ لهذا النهج المبتكر. تركيبة عالية الدقة 3D الفحص المجهري و TIRF قدمت وصفاً مفصلاً لهذه العمليات المعقدة داخل البيئة الخلوية، وفي الوقت نفسه، التعريب الدقيق للجزيئات المرتبطة بغشاء من الكشف، بارتفاع نسبة الإشارة إلى الخلفية.
Introduction
أيامنا، بتطوير تقنيات الفحص المجهري الخفيفة توفير تصوير القرار السامي/سوبر في ثابت والعينة الحية سريعاً. تقنيات فائقة القرار مثل حفز الانبعاثات استنفاد (STED)، منظم إضاءة مجهرية (SIM) وصور في تفعيل التعريب مجهرية (النخيل) أو إعادة البناء الضوئي العشوائية المباشرة مجهرية (العاصفة)، على التوالي، هي المتاحة تجارياً وتمكين تصوير هياكل سوبسيلولار عرض التفاصيل تقريبا في الحجم الجزيئي1،2،3،4،،من56. ومع ذلك، هذه النهج ما زالت محدودة الانطباق لتجارب التصوير الحية التي تحتاج إلى تصور مع إطارات متعددة في الثانية وسرعة اقتناء كميات كبيرة. أنواع مختلفة من عمليات ديناميكية للغاية تنظم عبر غشاء البلازما، مثل إندو-/الرقابة أو الالتصاق أو الهجرة أو إشارات، تحدث مع سرعة عالية داخل وحدات التخزين الخلوية الكبيرة. مؤخرا، من أجل ملء هذه الفجوة، كان أسلوب الفحص المجهري متكاملة المقترحة للغزل يسمى القرص-TIRF (SD-TIRF)7. بالتفصيل، تصاريح TIRF الفحص المجهري لعزل على وجه التحديد وتعريب8،غشاء البلازما9، بينما مجهرية SD واحدة من أكثر المسائل حساسية وسرعة يعيش تقنيات التصوير للتصور وتتبع سوبسيلولار العضيات في10،السيتوبلازم11. المزيج من كلا تقنيات التصوير في إعداد واحد قد تحققت فعلا في12،الماضي13، بيد المجهر المعروضة هنا (الشكل 1) وأخيراً يفي بمعايير القيام بتجارب التنمية المستدامة-TIRF التصوير الحي العمليات المذكورة آنفا على 3 إطارات في الثانية وسرعة. منذ هذا المجهر متاحة تجارياً، والهدف من هذه المخطوطة هو وصف في التفاصيل وتوفير أدوات مفتوحة المصدر وبروتوكولات للحصول على الصور والتسجيل والتصور المرتبطة بالفحص المجهري SD-TIRF.
يستند الإعداد مجهر مقلوب متصلة بوحدات الفحص اثنين عبر منافذ مستقلة-المنفذ الأيسر مرتبط بوحدة التنمية المستدامة والمنفذ مرة أخرى إلى وحدة الماسح الضوئي TIRF وصور–تنشيط/-تبييض التجارب. أشعة الليزر تصل إلى 6 (405/445/488/515/561/640 nm) يمكن أن تستخدم للإثارة. للإثارة والكشف عن إشارة الأسفار، أما علامة x 100/60 x أو زيت NA1.45/NA1.49 النفط الهدف TIRF، على التوالي، وقد استخدمت. الضوء المنبعثة هو تقسيم بواسطة مرآة مزدوج اللون (561 نانومتر طويلة-تمرير أو 514 nm منذ فترة طويلة-تمرير) وتتم تصفيتها بواسطة تمرير الفرقة مرشحات مختلفة (55 نانومتر واسعة تركزت في 525 نانومتر، 54 نانومتر واسعة تركزت في 609 نانومتر للأسفار الأخضر والأحمر، على التوالي) وضعت أمام اثنين كام م-مكافحة التصحر المناقصات الإلكترونية. يرجى ملاحظة أنه يتم سرد المزيد من التفاصيل الفنية حول برنامج الإعداد في زوبياك et al. 7. في تكوين TIRF، يتم نقل وحدة التنمية المستدامة خارج مسار الضوء داخل حوالي 0.5 s حيث أنه يمكن استخدام نفس اثنين من الكاميرات للكشف، مما يتيح سرعة التبديل بين طرائق التصوير اثنين مقارنة بحوالي 1 ثانية الذي تم الإعلام عنه في الماضي13 . تتيح هذه الميزة إمكانية اكتساب متزامنة مزدوجة القناة، وهكذا 4 القنوات SD-TIRF التصوير السرعة لا مثيل لها في السابق ويمكن تنفيذها بدقة. وعلاوة على ذلك، المواءمة بين التنمية المستدامة و TIRF الصور لا لزوم لها. محاذاة الصورة بين اثنين من الكاميرات، ومع ذلك، قد يمكن فحصها قبل البدء التجربة وتصحيحها إذا لزم الأمر. في البروتوكول التالية، تم تنفيذ روتين تصحيح تسجيل في ماكرو ImageJ الذاتي مكتوب. وعلاوة على ذلك، الماكرو صمم أساسا للسماح لمرئيات متزامنة TIRF الآدمية رغم أبعاد مختلفة والتنمية المستدامة. اقتناء البرمجيات نفسها لم تقدم هذه الميزات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي هذه الورقة عرض أول نجاح تنفيذ الفحص المجهري SD و TIRF في تكوين مناسب لإجراء تجارب التصوير خلية حية، أي الحصول على ارتفاع معدلات مثل 2 رصات الصور SD-TIRF في الدقيقة في مرحلة مختلفة 3 تم الحصول على المناصب، المقابلة لمجموعة إطارات 168 (حوالي 3 إطارات في الثانية الواحدة)،. وصف مجاهر SD TIRF القليل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر كثيرا المجتمع العلمي للجامعة الطبية مركز هامبورغ-ايبندورف لدعم منا مع العينات للتقييم. هي: نحن نشكر “سابين ويندورست” لخلايا NIH3T3، موردورست أندريا يفب-فينكولين ورودولف الإيطاليون لطلب تقديم العروض-ليفيكت.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Referências
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
