回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細
Summary
高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ イメージング実験画像のスタック毎秒。
Abstract
生きている細胞では、接着形成などのプロセスは、細胞膜と細胞内で広範な構造変化を伴います。ライブ サンプルの高速イメージングが可能 2 つの相補的な光学顕微鏡技術が結合されたこれらの非常に動的なイベントを視覚化するために: 高速で高解像度のボリューム録音および総内面反射の顕微鏡ディスク (SD) を回転正確な局在と細胞膜の可視化 (TIRF) 蛍光顕微鏡検査。試料作製、顕微鏡校正、画像形成および取得を通じた指導、多色・高時空間的解像度 SD 全反射イメージング ライヴ ・ シリーズの包括的かつ完全なイメージング プロトコルが表示されます。多次元のライブ イメージング データセット、すなわち登録および個々 のチャンネルの組み合わせを生成するためのすべての必要な画像後処理手順は、ImageJ のオープン ソース ソフトウェアの自己書かれたマクロで提供されます。開始時に蛍光タンパク質のイメージングおよび接着複合体の成熟だけでなく、アクチン細胞骨格ネットワークの形成は、この新たなアプローチの原則の証拠として使用されました。高解像度 3 D 顕微鏡や全反射の組み合わせがセルラ環境内および、同時に、高い検出膜準の分子の正確な局在これらの複雑なプロセスの詳細な説明を提供シグナル/バック グラウンド比。
Introduction
日々、固定高/超解像イメージングと生体試料を提供する光学顕微鏡技術は急速に発展します。超解像技術枯渇 (STED) 構造化照明顕微鏡 (SIM) と光活性化ローカリゼーション顕微鏡 (パーム) または直接確率光再建顕微鏡 (嵐) の刺激をそれぞれ、市販分子スケール1,2,3,4,5,6のほとんどの詳細を示す細胞レベル下の構造のイメージングを有効にして。ただし、これらのアプローチは、大量が 2 番目の集録速度あたり複数のフレームを可視化する必要がありますライブ イメージング実験の適用性をまだ制限が。非常にダイナミックなプロセスを介して細胞膜、例えば遠藤 – 規制の品種/エキソサイトーシス、粘着性、移行、シグナル伝達、細胞大量に高速で発生します。最近、このギャップを埋めるために統合された顕微鏡法は提案と呼ばれる回転ディスク-全反射 (SD 全反射)7だった。詳しくは、全反射型顕微鏡特に分離膜8,9をローカライズ、SD 顕微鏡は最も敏感なと高速可視化と追跡のためのイメージング技術をライブすることができます。細胞質10,11細胞小器官。単一のセットアップの両方のイメージング技術の組み合わせが過去12,13で実現されている、ただし、ここ (図 1) に示す顕微鏡は最後にライブ イメージング SD 全反射実験を実行する条件を満たしています。3 コマ/秒のスピードで前述のプロセス。この顕微鏡は市販、この原稿の目標は詳細を説明して、画像の取得、登録、および関連付けられている SD 全反射型顕微鏡可視化のためのオープン ソース ツールやプロトコルを提供することです。
セットアップは、独立したポートを介して 2 つのスキャン ユニットに接続されている倒立顕微鏡に基づいている – の左側のポートは全反射し、光活性化/-漂白の SD ユニット、スキャナー ユニットを背面のポートにリンクされる実験。最大 6 レーザー (405/445/488/515/561/640 nm) 励起に使用することができます。励起とどちらか 100 x 蛍光信号の検出/NA1.45 オイルまたは 60 x/NA1.49 オイル全反射の目的、それぞれ採用されています。放出される光はダイクロイック ミラー (561 nm ロングパスまたは 514 nm ロングパス) によって分割し、様々 な帯域通過フィルターによってフィルター処理 (55 nm 幅 525 を中心とした nm、54 nm 幅 609 を中心とした緑と赤の蛍光の nm それぞれ) 2 つの EM CCD カムの前に置かれました。時代 (年号)。Zobiakらのセットアップに関するより技術的な詳細が表示されていることに注意してください。70.5 年頃内光路から移動された SD ユニット全反射構成で s ように同じの 2 台のカメラは、検出に使用することができます、1 年頃と比較すると 2 つの画像診断装置の高速切り替えをできるように、過去に報告された s13 。この機能により、デュアル チャネル同時取得、したがって 4 チャンネルは SD 全反射イメージング以前で比類のないスピード、精度を実行することができます。また、SD と TIRF 画像間の位置合わせは必要ありません。2 つのカメラ間のイメージの配置は、ただし、実験を開始する前にチェックし必要に応じて修正あります。次のプロトコル登録修正ルーチンは自己 ImageJ マクロで実装されていました。さらに、マクロに sd と、異なる次元にもかかわらず全反射データセットの同時可視化できるように設計されました。集録ソフトウェア自体は、これらの機能を提供しませんでした。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿で示したライブセル イメージング実験、3 の異なるステージで 1 分あたり 2 SD 全反射画像のスタックなど高い獲得率すなわちを実行に適した構成で SD と全反射顕微鏡の最初の成功の実装合計 (およそ毎秒 3 フレーム)、168 のフレームに対応する位置に買収されました。されたいくつかの SD 全反射顕微鏡は前述12,13、主に、3 D の細胞プロ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
科学界の医療センター ハンブルク大学エッペンドルフ評価用サンプルで私たちを支援するため大いに感謝いたします。すなわち、NIH3T3 細胞、YFP ビンキュリンのアンドレア ・ Mordhorst と RFP Lifeact のマレン ルドルフをザビーネ Windhorst を感謝いたします。
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Referências
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