Micronizzazione meccanici di Lipoaspirates per la terapia rigenerativa
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per ottenere frazione vascolari stromali da tessuto adiposo attraverso una serie di processi meccanici, che includono emulsificazione e centrifugazioni multiple.
Abstract
Frazione vascolare stromal (SVF) è diventato uno strumento rigenerativo per varie malattie; Tuttavia, la legislazione disciplina rigorosamente l’applicazione clinica dei prodotti delle cellule usando collagenosi. Qui, presentiamo un protocollo per generare una miscela iniettabile di SVF cellule e matrice extracellulare nativa dal tessuto adiposo di un processo puramente meccanico. Lipoaspirates sono messi in una centrifuga e filata a 1.200 x g per 3 min. Lo strato intermedio è raccolto e separato in due strati (ad alta densità grasso nella parte inferiore) e grasso a bassa densità in alto a sinistra. Lo strato superiore è emulsionato direttamente spostando intersyringe, ad un tasso di 20 mL/s per 6 x a 8 x. Il grasso emulsionato viene centrifugato a 2.000 x g per 3 min, e la sostanza appiccicosa sotto lo strato di olio è raccolto e definita come la matrice extracellulare (ECM) / SVF-gel. L’olio sullo strato superiore è raccolto. Circa 5 mL di olio è aggiunto a 15 mL di grasso ad alta densità ed emulsionati spostando intersyringe, ad un tasso di 20 mL/s per 6 x a 8 x. Il grasso emulsionato viene centrifugato a 2.000 x g per 3 min, e la sostanza appiccicosa è anche ECM/SVF-gel. Dopo il trapianto di ECM/SVF-gel in topi nudi, l’innesto è raccolto e valutato da esame istologico. Il risultato mostra che questo prodotto ha il potenziale per rigenerare nel normale tessuto adiposo. Questa procedura è una procedura di dissociazione meccanica semplice ed efficace per condensare le cellule SVF incorporate nel loro naturale ECM solidale per scopi rigenerativi.
Introduction
Terapie con cellule staminali forniscono un cambio di paradigma per la rigenerazione e riparazione tissutale, affinché possano offrire un regime terapeutico alternativo per varie malattie1. Cellule staminali (ad es., cellule staminali pluripotenti indotte e cellule staminali embrionali) hanno un grande potenziale terapeutico, ma sono limitate a causa di regolazione cellulare e considerazioni etiche. Adiposo-derivate mesenchimali stromali/cellule staminali (ASCs) sono facili da ottenere da lipoaspirates e non sono soggetti alle stesse restrizioni; così, è diventata un tipo di cellula ideale per la pratica della medicina rigenerativa2. Inoltre, sono nonimmunogenic e hanno abbondanti risorse da grasso autologo3.
Attualmente, ASC sono ottenute principalmente con la digestione della collagenosi-mediata del tessuto adiposo. La frazione di vascolare stromal (SVF) del tessuto adiposo contiene ASCs, cellule endoteliali progenitrici, periciti e cellule del sistema immunitario. Anche se ottenere un’alta densità di SVF/ASC enzimaticamente è stato indicato per avere effetti benefici, la legislazione in diversi paesi disciplina rigorosamente l’applicazione clinica dei prodotti cellulari utilizzando collagenosi4. Digerendo il tessuto adiposo con collagenasi per 30 min a 1 h per ottenere cellule SVF aumenta il rischio di entrambi materiale esogeno nella preparazione e nella contaminazione biologica. La cultura aderente e la purificazione di ASC, che richiede giorni a settimane, richiede attrezzature specifiche di laboratorio. Inoltre, nella maggior parte degli studi, le cellule SVF e ASC sono utilizzati in sospensione. Senza la protezione della matrice extracellulare (ECM) o un altro vettore, celle libere sono vulnerabili, causare una ritenzione di povera cella dopo l’iniezione e compromettere il risultato terapeutico5. Tutti questi motivi limitare l’ulteriore applicazione della terapia con cellule staminali.
Per ottenere ASCs dal tessuto adiposo senza digestione della collagenosi-mediata, parecchie procedure di lavorazione meccanica, tra cui centrifugazione, meccanica, tagliere, triturazione, sminuzzare e tritare, sono stati sviluppati6,7 , 8 , 9. questi metodi sono pensati per condensare tessuto e ASC interrompendo meccanicamente adipocytes maturi e loro vescicole contenenti olio. Inoltre, queste preparazioni, contenenti elevate concentrazioni di ASC, ha mostrato un notevole potenziale terapeutico come medicina rigenerativa in animale modelli8,9,10.
Nel 2013, Tonnard et al ha introdotto il nanofat innesto tecnica che prevede di produrre emulsionati lipoaspirates intersyringe elaborazione11. La forza di taglio creata da intersyringe spostando in modo selettivo può rompere adipocytes maturi. Basato sui loro risultati, abbiamo sviluppato un metodo di lavorazione puramente meccanici che rimuove la maggior parte del lipido e liquido in lipoaspirates, lasciando solo le cellule SVF ed ECM frazionato, che è ECM/SVF-gel12. Qui, descriviamo i dettagli del processo meccanico di derivazione umana di tessuto adiposo per produrre il ECM/SVF-gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terapia rigenerativa basata su cellule staminali ha mostrato un grande potenziale beneficio in diverse malattie. ASC sono i candidati terapeutici eccezionali perché sono facili da ottenere e avere la capacità di riparazione dei tessuti e la rigenerazione di tessuti romanzo15. Tuttavia, esistono limitazioni ad espandere la sua applicazione clinica, poiché richiede complicate procedure per isolare le cellule e la collagenosi per l’elaborazione di6. Quindi, è essenziale pe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di scienza natura nazionale della Cina (81471881, 81601702, 81671931), il fondamento di scienza naturale della provincia di Guangdong (2014A030310155) e l’amministratore Foundation di Nanfang Hospital (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
Referências
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