Micronización mecánica de Lipoaspirates para la terapia regenerativa

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para obtener la fracción vascular estromal de tejido adiposo a través de una serie de procesos mecánicos, que incluyen múltiples centrifugados y emulsificación.

Abstract

Fracción vascular estromal (SVF) se ha convertido en una herramienta regenerativa para varias enfermedades; sin embargo, la legislación regula estrictamente la aplicación clínica de células usando colagenasa. Aquí, presentamos un protocolo para generar una mezcla inyectable de SVF células y matriz extracelular nativa del tejido adiposo mediante un proceso puramente mecánico. Lipoaspirates se pone en una centrífuga y rota a 1.200 x g durante 3 minutos. La capa media se recoge y se separa en dos capas (alta densidad grasa en la parte inferior) y baja densidad grasa en la parte superior. La capa superior se emulsiona directamente cambiando de intersyringe, a un ritmo de 20 mL/s de 6 x a 8 x. La grasa emulsionada se centrifuga a 2.000 x g durante 3 min, y la sustancia pegajosa en la capa de aceite se recoge y se define como la matriz extracelular (ECM) / gel de SVF. Se recoge el aceite en la capa superior. Aproximadamente 5 mL de aceite se añade a 15 mL de grasa de alta densidad y emulsionado cambiando de intersyringe, a un ritmo de 20 mL/s de 6 x a 8 x. La grasa emulsionada se centrifuga a 2.000 x g durante 3 min, y la sustancia pegajosa es SVF/ECM-gel. Después del trasplante del ECM o SVF-gel en ratones desnudos, el injerto es cosechado y evaluado por la examinación histologic. El resultado demuestra que este producto tiene el potencial para la regeneración en el tejido adiposo normal. Este procedimiento es un procedimiento de disociación mecánica simple y efectiva para condensar las células SVF incrustadas en su natural apoyo ECM con fines regenerativos.

Introduction

Terapias con células madre ofrecen un cambio de paradigma para la regeneración y reparación de los tejidos por lo que pueden ofrecer un régimen terapéutico alternativo para varias enfermedades¹. Las células madre (p. ej., células madre pluripotentes inducidas y las células madre embrionarias) tienen un gran potencial terapéutico pero son limitadas debido a la regulación de la célula y consideraciones éticas. Derivados del adiposo mesenquimales estromales/células madre (ASCs) son fáciles de obtener de lipoaspirates y no está sujeto a las mismas restricciones; así, se ha convertido en un tipo de célula ideal para medicina regenerativa práctica². Además, son nonimmunogenic y tienen recursos abundantes de grasa autóloga³.

En la actualidad, ASCs se obtienen principalmente por digestión con colagenasa-mediada del tejido adiposo. La fracción vascular estromal (SVF) de tejido adiposo contiene ASCs, células progenitoras endoteliales, pericitos y células inmunes. Aunque obtener una alta densidad de SVF/ASC enzimático fue demostrado para tener efectos beneficiosos, la legislación en varios países regula estrictamente el uso clínico de productos basados en células con colagenasa⁴. Digerir el tejido adiposo con colagenasa durante 30 min a 1 h para obtener células SVF aumenta el riesgo de material exógeno en la preparación y la contaminación biológica. La cultura adherente y la purificación de la ASC, que dura días a semanas, requieren equipo de laboratorio específico. Por otra parte, en la mayoría de los estudios, las células SVF y ASC se utiliza en suspensión. Sin la protección de matriz extracelular (ECM) o de otro transportista, células libres son vulnerables, causar una retención celular pobre después de la inyección y comprometer el resultado terapéutico⁵. Todas estas razones limitan el uso adicional de la terapia de células madre.

Para obtener ASCs de tejido adiposo sin digestión mediada por la colagenasa, varios procedimientos de tratamiento mecánico, como centrifugación, mecánico para picar, triturar, triturar y picar, han sido desarrollados^{6,7 , 8 , 9}. estos métodos se piensan para condensar tejido y ASCs interrumpiendo mecánicamente adipocytes maduros y sus vesículas que contienen el aceite. Por otra parte, estos preparados, que contienen altas concentraciones de ASCs, demostraron un potencial terapéutico considerable como medicina regenerativa en animales modelos^8,9,10.

En 2013, Tonnard et al. introdujo la nanofat injerto técnica, que consiste en producir emulsionado lipoaspirates intersyringe procesamiento¹¹. La fuerza de corte por intersyringe cambio selectivamente puede romper adipocitos maduros. De acuerdo con sus resultados, se desarrolló un método de proceso puramente mecánico que quita la mayor parte de los lípidos y el líquido en el lipoaspirates, dejando solamente las células SVF y ECM fraccionada, que es el SVF/ECM-gel¹². Adjunto, describimos los detalles del proceso mecánico de derivados humanos el tejido adiposo para producir el gel o SVF-ECM.

Protocol

Esta investigación fue aprobada por la Junta de revisión ética en Nanfang Hospital, Cantón, China. Tejido adiposo se obtuvo de donantes sanos que dieron consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Nanfang Hospital institucional Animal cuidado y uso y realizados según los lineamientos de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (China). 1. ECM/SVF-gel de preparación La cosecha de g…

Representative Results

Después de procesar la grasa Coleman a gel o SVF-ECM, el volumen de petróleo desechado ocupa 80% del volumen final, y sólo el 20% de tejido adiposo conservado bajo la capa de aceite se considera como ECM o SVF-gel (figura 1A). ECM/SVF-gel tiene una textura suave de tipo líquido que le permite ir a través de una aguja fina 27 G; sin embargo, Coleman grasa se compone de una estructura grasa integral con fibras grandes y sólo puede ir a tr…

Discussion

Terapia Regenerativa de células madre ha mostrado un gran beneficio potencial en diferentes enfermedades. ASCs son candidatos terapéuticos porque son fáciles de obtener y tienen la capacidad de reparación de los tejidos y la regeneración de nuevos tejidos¹⁵. Sin embargo, existen limitaciones a la expansión de su uso clínico, ya que requiere procedimientos complicados para aislar células y colagenasa para el procesamiento de⁶. Por lo tanto, es esencial desarrollar un…

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus