Summary

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

Published: January 17, 2019
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Summary

ここでは、単一 subtelomere で MS2 シーケンス タグを含む癌細胞のクローンを生成するためのプロトコルを提案する.MS2 GFP システムに依存して、このアプローチは、内因性の転写産物のテロメア繰り返し含む RNA (テラ) 生きている細胞の単一テロメアから表現の可視化を実現。 にします。

Abstract

テロメアは、転写、テロメア長鎖非コード Rna (テラ) の繰り返しを含むに上昇を与えるテロメア生物学、ヘテロクロマチン形成とテロメアの長さの恒常性などで重要な役割を果たしているが提案されています。最近の知見では、テラの分子はまたマウス胚性幹 (ES) 細胞における遺伝子発現を調整するために内部の染色体領域と対話することを明らかにしました。この証拠に沿った RNA 蛍光の in situハイブリダイゼーション (RNA 魚) 分析サブセットのみが示されている染色体の両端にテラのトラン スクリプトをローカライズします。テラ分子のダイナミクスの理解は、彼らの機能と作用機構を定義に役立ちます。ここでは、ラベルし、MS2 GFP を用いた癌細胞の単一テロメア テラ転写物を可視化する手法について述べる。この目的に単一の subtelomere で統合 MS2 シーケンスを含んでいる AGS ヒト胃がん細胞ラインを使用して安定したクローンを生成するプロトコルを提案します。MS2 タグ テロメアからテラの転写は、GFP (MS2 GFP) を融合した MS2 RNA 結合タンパク質の共発現時に生細胞の蛍光顕微鏡による可視化 MS2 タグ テラ分子の発現の結果します。このアプローチにより、癌細胞の単一テロメア テラ分子のダイナミクスを研究する研究者とその他の細胞に適用できます。

Introduction

染色体の subtelomeric 領域から長鎖非コード RNA テラを転写し、その転写染色体はテロメアの繰り返し管1,2内終了終了へ向かって。このため、テラの成績証明書は 5′ 端に subtelomeric の派生シーケンスから成り、テロメアの繰り返し (脊椎動物の UUAGGG)3で終了します。重要な役割は、テロメア4,5, DNA 複製6、染色体の間での相同組換えの促進のヘテロクロマチン形成を含む終了する7,8テラ、提案されています。,9、テロメア構造10およびテロメアの長さの恒常性2,11,12,13を規制します。さらに、テラの成績証明書は、マウス胚性幹 (ES) 細胞14における広範な遺伝子発現を調節する多数の extratelomeric サイトと対話します。これらに伴い、RNA 蛍光性の現場の交配 (RNA 魚) 解析はテラ成績のサブセットのみを示している証拠はテロメア1,2,15ローカライズします。さらには、テラはマウス細胞2,16の X および Y 染色体でローカライズする原子集合体を形成する報告されています。テラ成績が核内の複雑なダイナミクスを受けることが示唆されました。テラ分子のダイナミクスを理解し彼らの機能と作用機構を定義するのに役立ちます。

MS2 GFP システムは、広く様々 な生物17,18から細胞内 RNA 分子を可視化するために使用されています。このシステムは、タグを出芽酵母12,19のシングル テロメア テラ分子を可視化する以前使用されています。このシステムを使用すると、最近、酵母テラ成績証明書をポスト発酵から呼吸へシフト フェーズでローカライズ細胞質内テラ可能性がありますにおける核外機能20を及ぼすことを示唆しているが示されました。最近がん細胞21シングル テロメア テラ トラン スクリプトを勉強する MS2 GFP システムを使いました。この目的には、MS2 単一テロメア (テロメア 15q、以下 Tel15q) でシーケンスを統合する CRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを採用し、MS2 タグ内因性 Tel15q テラ (テラ MS2 クローン) の表現のクローンを得た。認識し、生活で単一テロメア テラ成績の MS2 RNA シーケンスにより可視化を結合する GFP 融合 MS2 RNA 結合タンパク質 (MS2 GFP) の共発現細胞21です。ここに示されているプロトコルの目的は、テラ MS2 クローンの生成のために必要な手順の詳細に説明することです。

テロメア 15q、subtelomeric 地域で統合され、MS2 カセット テラ MS2 のクローンを生成するテラ プロモーター領域と転写開始部位の下流。MS2 カセットには lox p サイトに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が含まれています、subtelomere 15q での統合は、CRISPR/Cas9 システム22を使用して実行されます。カセット、単一クローン MS2 のトランスフェクションが選択され PCR によってカセットの subtelomeric 統合が確認されたら、DNA 配列と南部のしみ。肯定的なクローンは、subtelomere 15q で単一 lox p サイト MS2 シーケンスだけを残して、カセットの選択マーカーを除去するために Cre を発現アデノ ウイルスに感染しています。RT qPCR により Tel15q からタグ付きの MS2 のテラの式を確認すると.最後に、MS2 GFP の融合蛋白質を表現に蛍光顕微鏡による MS2 テラ成績を視覚化するためにレトロ ウイルス感染テラ MS2 クローンで。RNA 魚でテラの成績証明書を容易に検出できるし、テロメア繰り返し固有を使用して生細胞イメージング プローブ1,2,15,23。これらのアプローチは、単一セルの解像度でテラ分子の総人口の局在に関する重要な情報を提供します。単一 subtelomere で MS2 シーケンスを含んでいるクローンの生成には、関数とテラの作用のメカニズムを定義する生きた細胞の単一テロメア テラ転写物のダイナミクスを研究する研究者が有効になります。

Protocol

1。ネオマイシン耐性クローンの選択 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、2 mM L グルタミン、ペニシリン (媒体の mL あたり 0.5 単位)、37 ° C、5% CO2でストレプトマイシン (媒体の mL あたり 0.2 μ g) とハムの F-12_K (Kaighn) 培の AGS セルを育てます。SgRNA/Cas9、1:10 でベクトルと MS2 カセットを表現すると 50-60% の合流点で細胞を transfect モル比21。注: 並列実験 gfp 発現するベクト?…

Representative Results

図1は、実験的戦略の概要を表します。プロトコルとテラ MS2 AGS 細胞クローンの生成を示すタイムラインの主な手順 (図 1A) のとおりです。1 日で 6 ウェル プレートの複数の井戸が MS2 カセット、sgRNA/Cas9 (図 1Bに示すように) ベクトルを表現するをトランスフェクトしま…

Discussion

この記事では MS2 シーケンス subtelomere 15q 内に統合を含むひと癌細胞のクローンを生成する手法を提案します。これらのクローンを使用して、subtelomere 15q から転写 MS2 タグ テラ分子は、MS2 GFP 融合タンパク質の共発現による蛍光顕微鏡で検出されます。このアプローチにより、単一から表明したテラのダイナミクスを研究する研究者生活のテロメア細胞21。このプロトコルで?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CIBIO トレント大学での高度なイメージング機能、ウィーンの BioOptics 光顕微鏡施設 Max F. ペルーツ研究所 (MFPL) でのスタッフに感謝しております。これらの結果につながる研究資金を受けている Mahlke-谷、同財団、研究、技術開発およびデモンストレーションのため欧州連合の第 7 フレームワーク プログラムから付与契約の下でない 609431 ecEC は、大学教育と研究 (MIUR) のイタリア省からリタ レヴィ モンタルチーニ交わりによってサポートされます。

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

Referências

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Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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