Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM) イメージング技術を使用して単一分子レベルでのヌクレオソーム粒子の特性評価にプロトコルを提案します。説明表面機能化手法により構造のキャプチャとダイナミクスのヌクレオソームのナノスケールで高解像度。

Abstract

ヌクレオソームのサブユニットの長い鎖であるクロマチンは、真核細胞の DNA 複製と転写を場所としてこのような重要なプロセスは、動的なシステムです。ヌクレオソームのダイナミクスは、dna 複製と転写の機械によってアクセスが提供し、クロマチン機能発現の分子機構に非常に貢献します。イメージング原子間力顕微鏡 (AFM) など単一分子の研究は、ヌクレオソーム構造とダイナミクスの役割の私達の現在の理解に大きく貢献しています。現在のプロトコルは、ヌクレオソームの構造と動的性質の研究に高分解能 AFM イメージングを有効にする手順を説明します。プロトコルは、H3 ヒストンがその相手の動原体タンパク質 (セントロメア) に置き換えられますセントロメア ヌクレオソームの得られた原子間力顕微鏡データによって示されています。プロトコルは連続希釈法によるモノラル ヌクレオソームのアセンブリに始まります。基板を準備する手順は、説明および説明ヌクレオソームの原子間力顕微鏡可視化修飾とヌクレオソーム イメージングに使用されるアミノプロピル silatrane (APS-雲母) マイカ基板の準備が欠かせません。ヌクレオソーム APS 雲母表面上まずヌクレオソーム人口のスナップショットをキャプチャする静的 AFM を用いたが作成されます。これらの画像解析からラップされたヌクレオソーム DNA のサイズなどのパラメーターを計測でき、このプロセスはまた、詳細な。液体内のプロシージャをイメージング タイムラプス AFM はいくつかのフレームをキャプチャすることができます高速コマ撮り AFM について 1 秒あたりヌクレオソーム ダイナミクスの。最後に、動的過程の定量的な解析を有効にするヌクレオソーム ダイナミクスの解析が説明し、イラストします。

Introduction

真核細胞の DNA は高度に凝縮し、染色体に組織です。1染色体内の DNA 組織の最初のレベルは、147 のヌクレオソームのアセンブリ DNA の bp は密ヒストン八量体コアに巻いた。2,3ヌクレオソーム粒子単位で非常に小型の染色体が形成されるまではそれから組織されるクロマチンの配列を形成する長鎖 DNA 分子を組み立てます。4クロマチンの分解は DNA 遺伝子の転写とゲノムの複製など重要な細胞プロセスで必要とされる、クロマチンが非常に動的なシステムを無料へのアクセスを提供します。5,6,7さまざまなクロマチン レベルで DNA の動的プロパティを理解が間違いが細胞死やがんなどの病気の開発につながることができる分子レベルの遺伝的プロセスを解明するため重要です。8重要なクロマチン プロパティはヌクレオソームのダイナミクスです。9,10,11,12これらの粒子の高い安定性が結晶学的手法による構造特性できました。2どのようなこれらの研究不足、ヌクレオソーム DNA のメカニズムなどの動的詳細アンラッピング ヒストン コアから動的な経路は転写および複製の過程で必要です。7,9,13,14,15,16また、因子と呼ばれる特別な蛋白質ヌクレオソーム粒子17の分解を容易にするために示されています。ただし、ヌクレオソームの本質的なダイナ ミックスは全体分解プロセスに貢献するこのプロセスで重要な要因であります。14,16,18,19

単一分子蛍光19,20,21、光学トラップ (ピンセット)13,18,22,23 AFM などの単一分子技術10,14,15,16,24,25,26はヌクレオソームのダイナミクスを理解することに尽力されています。これらの方法のいくつかのユニークで魅力的な機能から原子間力顕微鏡の利点します。原子間力顕微鏡を視覚化しより長い配列27と同様、ヌクレオソームを特徴付けることができます。AFM 像からヌクレオソーム構造 DNA のヒストンのコアの周りをラップの長さなどの重要な特性は、測定10,14,26,28をすることができます。ヌクレオソーム アンラップ ダイナミクスの解析の中核となるパラメーターです。過去の原子間力顕微鏡の研究は非常に動的なシステム、DNA がヒストン コア14から自発的にラップを解除できますヌクレオソームを明らかに。ヌクレオソームから DNA の自発的な開梱は afm イメージングが水溶液14,26,29終わったらタイムラプス モードで動作直接可視化した.

高速コマ撮り原子間力顕微鏡 (AFM HS) 計測器の出現は、ミリ秒のタイム スケール14,15,24ヌクレオソーム アンラッピングを可視化を可能にしました。セントロメア特定ヌクレオソームの最近の HS AFM 16,30研究では、標準型に比べヌクレオソームのいくつかの新しい機能を明らかにしました。動原体、染色体分離31の批判的に重要な染色体の一部分のセントロメア ヌクレオソームを構成します。一括クロマチンの正規ヌクレオソームとは異なりは、セントロメア ヌクレオソームのヒストンのコアにはヒストン H332,33ではなくセントロメア ヒストンが含まれています。このヒストン置換結果のセントロメア ヌクレオソーム DNA ラッピングは ~ 120 ~ 147 ではなく bp 正規ヌクレオソーム; の bpセントロメアと正規のヌクレオソームの明瞭な形態をもたらすことができる違いは配列34セントロメア クロマチンを受ける 1 一括に比べ高いダイナミクスを示唆しています。HS AFM16,30研究におけるセントロメア ヌクレオソームで表示される新しいダイナミクス例示の構造と動的特性を直接可視化するこの 1 分子技術によって提供されるユニークな機会ヌクレオソーム。これらの機能の例を簡単に説明し、用紙の端に示されているが。既存のメソッドの変更と同様、ヌクレオソームの AFM イメージングの新しいプロトコルの開発により進歩だった。ここで説明したプロトコルの目的は、単一分子の原子間力顕微鏡のヌクレオソームの研究でこれらの刺激的な進歩のクロマチンの調査でこれらのテクニックを利用したいと思います誰かにアクセスできるようにです。説明されている技法の多くは、ヌクレオソームの研究を超えて問題に適用され他の蛋白質および興味の DNA システムの調査のため使用することができます。出版物35,36,37,38,39,40,41、このようなアプリケーションのいくつかの例を見つけることができます。 42,43,44,45,46,47,48,49と原子間力顕微鏡学の展望様々 な生体分子システムを与えられているレビュー29,50,51,53,54。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 連続希釈モノラル ヌクレオソームのアセンブリ

  1. 生成し、シーケンスを配置オフ中心の Widom 601 ヌクレオソームを含む約 400 bp の DNA 基質を浄化します。55
    注: 不要なディ ヌクレオソーム形成を制限する位置決めシーケンスの前後それぞれの '腕' を超えない ~ 150 bp。
    1. 設計されたプライマーと一緒にプラスミド pGEM3Z 601 を使用して PCR を使用して基板の DNA を増幅します。122 と 154 bp アーム長さがここで使用される 423 bp 基板、前方を使用 (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') および逆引き (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') プライマー。
    2. 95 ° C に予熱チューブをサーマルサイクラーに反応混合物を含むを追加します。95 ° C、30 秒は、49 ° c の熱処理、72 ° c. で 35 s 延長 95 ° c: 30 の変性で 5 分間初期変性後 33 サイクルの次のプログラムを実行します。72 ° C 10 分 33 サイクル、次で最後の拡張を設定します。
    3. 市販 PCR 精製キットを使用して pcr から DNA を浄化します。PCR クリーンアップ列から DNA を溶出溶出バッファーを提供されるキットの代わりに 10 mM Tris バッファー (pH 7.5) を使用します。
      注: ない精製工程間バッファーを転送する余分な注意してください。問題が発生することができます汚染された溶離液下流 DNA 濃度の測定やヌクレオソーム アセンブリ混合物の開始濃度を変更できます。
  2. 260 で浄化された DNA の吸光度を測定することによって DNA 濃度を決定する nm。
    1. 紫外可視分光光度計 10 mM Tris pH 7.5 溶出バッファーのみを使用して空白を収集します。浄化された DNA の測定を収集します。
  3. 濃度決定、0.6 mL および microfuge の管に精製した DNA の分注 25 pmol、真空、遠心分離機で置きます解決策が見えない。通常は 1 時間 30 分です。
    メモ: DNA 基板、ヌクレオソーム アセンブリの準備ができています。プロトコルをここで一時停止することができ、使用するまで-20 ° C で保存されている DNA。
  4. 25 pmol 氷の上の DNA を含むおよび microfuge の管を置き、順序でテーブル 1、ヌクレオソーム アセンブリ構成部品を追加します。すべてのコンポーネントを追加すると、混合物を氷から外し、この部屋の温度 (RT) で 30 分間インキュベートします。
    注: 株価ヒストン バッファーの塩分が 2 M の最終的な集中を達成するために必要な生理食塩水を計算するときと見なされることが重要です。15,56
  5. 連続速度希釈を使用して 200 ミリメートルに混合物の 2 M の塩濃度を減らすことでヌクレオソームを組み立てます。57
    1. 10 mM Tris pH 7.5 を含む希釈バッファーの 100 μ L で注射器を記入し、シリンジ ポンプの上に置きます。
    2. 直接および microfuge の管の帽子の前にパンクした穴から注射器の針は、アセンブリ混合物 (図 1) で作られています連絡先を確保します。
    3. 120 分 0.75 μ L/分の速度で注射器のポンプを実行します。
      注: 結果の 100 μ L ソリューションには、250 nM ヌクレオソームと 200 mM の NaCl が含まれています。
    4. 10 K MWCO 透析ボタンに混合物を転送し、4 ° C で 1 時間 10 mM Tris pH 7.5、0.25 ミリメートルの EDTA および 2.5 mM の NaCl を含む中古冷蔵 (4 ° C) 低い塩バッファーの 200 mL に対して dialyze
  6. ヌクレオソーム アセンブリのヒストンの内容を評価するために分離する 15% と 6% 前述30スタッキング不連続 SDS ページのゲルを準備します。
    1. 割り切れるヌクレオソームの 10-20 μ L および microfuge の管をストックし、1-2 x の作業濃度に塩化物イオン サンプル バッファー x 4 を追加します。58
    2. コントロールとしてヒストン株式の 1-2 μ g の別および microfuge の管でこの準備を繰り返します。95 ° C でサンプルを熱 〜 5 分。
    3. ゲルで互いに隣接する車線のサンプルを読み込みます。でもバンド移行を促進するために未使用の車線にサンプルバッファーを追加します。
    4. スタッキングのゲルを通って移動する色素フロントまで 65 V でゲルを実行します。分離ゲルに達したら、150 V に増加し、染料のフロントが、ゲルから完全に移行するまでを実行します。
    5. 電気泳動装置を解体し、優しく dd H2o. を入れた染色容器にゲルを転送穏やかな攪拌 5 分間座っているゲルをしましょう。新鮮な dd H2O のたびに使用でさらに 2 回繰り返します。
      注: このプロトコルで使用される Coomassie の染色法では、Coomassie の汚れ (材料の表を参照してください) に必要な典型的な固定の手順は必要ありません。別 Coomassie 準備を使用している場合は、必要に応じて固定の手順を調整します。
    6. 最終すすぎから水を除去し、ゲルをカバーするだけの十分な染色を追加します。少なくとも 1 時間のために穏やかな攪拌と座っているゲルをしましょう。
      注: を攪拌、染色のコンテナーはまた液体で覆われているゲルを維持しながらゲルを染色の動きを促進する装置に配置できます。
    7. コンテナーから汚れを削除して dd H2O を置き換える dd H2O でゲルを洗浄 30 分穏やかな動揺のためのゲルを浸します。(ゲル ヒストン バンドの明確な分離に示すような図 2表示する必要があります)。
  7. 使用するまで 4 ° C、ヌクレオソームを格納します。
    注: これらの条件で保存されると、ヌクレオソーム安定して数ヶ月。プロトコルはここで一時停止することができます。

2. ヌクレオソームの静的 AFM イメージング用マイカ表面の機能化

  1. 前述の脱イオン水 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS ストック溶液を調製します。このソリューションで使用するまで 4 ° C の30店 1 mL 因数。
    注意: 因数が 4 ° C で 1 年以上の保存することができます。59
  2. 15 mL dd H2o. の 50 ミリメートルの APS 株式の 50 μ L を溶解することにより雲母の変更作業 AP 1: 300 ソリューションを準備します。
    注: この実用的なソリューションは、数日間室温で保存することができます。
  3. 雲母 (マイカはここで使用される材料表参照) 高品質雲母シートの 1 x 3 cm のストリップをカットします。
    1. キュベットに斜めに置かれたときに作品が収まることを確認してください。両方の側面がたてに切断され、作品は肉厚 ~0.1 mm (図 3 a) まで、雲母の層を切断するのに鋭いピンセット、かみそりの刃、セロハン テープなどのヒントを使用します。すぐに AP いっぱいキュベットに雲母片を配置し、(図 3 b) で 30 分間インキュベートします。
  4. Dd H2O および 30 のソーク満ちてキュベットに雲母片を転送 s (図 3)。アルゴン流動下で APS 雲母ストリップの両側を完全に乾燥させます。
    注: 不織セルロースとポリエステル クリーン ワイプ (材料の詳細な推奨ワイプ) 乾燥するとき、マイカの端から水を吸湿発散性で支援するために使用できます。
  5. 使用乾燥雲母ストリップは今サンプル準備です。そうでなければ、きれいな、乾燥のキュベット (図 3 D) に作品を保存します。
    注: 環境は湿度が高い場合は、1-2 時間のための真空でストレージを追加を勧めします。プロトコルはここで一時停止することができます。

3. 静的 AFM イメージングのための APS 雲母ヌクレオソーム試料の調製

  1. いくつかの磁気 pucks に両面粘着テープを適用し、側に配置します。
  2. 目的のサイズ (ここで使用される MM AFM 計測器の 1 × 1 cm の正方形) に APS マイカ基板をカットします。きれいなペトリ皿にこれらの作品を配置してカバー。
  3. 準備 3 希釈組み立てヌクレオソーム (最終ヌクレオソーム濃度 0.5、1.0 と 2.0 nM) のバッファー含む 10 mM HEPES pH 7.5 と 4 mM MgCl20.22 μ m を使用してフィルター処理されました。
    注: 低最終濃度ヌクレオソームの損失を制限するには、希釈されるべきである APS 雲母の蒸着の直前に一度に 1 つずつ。
  4. 預金 APS 雲母片の中央にサンプルし、希薄化後のヌクレオソームの 5-10 μ L 2 分間インキュベートします。Dd H2O バッファーのすべてのコンポーネントを削除する 2 〜 3 mL のサンプルを優しくすすいでください。各 dd H2O 使用 ~0.5 mL 後余分なすすぎ水を削除する雲母を軽く振る。
    注: この手順で洗浄には、使い捨て注射器の使用をお勧めします。
  5. きれいなアルゴンのガスの光の流れの下で堆積したサンプルを乾燥させます。
    注: サンプル イメージを作成する準備が整いましたか真空キャビネットに格納することができますまたはデシケータ充填アルゴン.サンプル調製し、保存され前述は、1 年次のない品質の損失と準備イメージが作成されました。プロトコルはここで一時停止することができます。

4. ヌクレオソームの静的 AFM イメージング

  1. チップ ホルダーの AFM チップをマウントします。~ 40 N/m と 300 と 340 kHz の間の共振周波数のばね定数は、ヒントを使用して、(ここで使用するカンチレバーの材料表を参照してください)。
  2. 第 3 節で試料表面に連絡しないように注意して原子間力顕微鏡ステージ上調製した試料をマウントします。
  3. までの合計は最大でカンチレバー上レーザー、ゼロの近くに縦方向と横方向のたわみの値を調整します。
  4. その共振周波数を検索し、ドライブ振幅を調整 100 × 100 にイメージのサイズを設定する AFM プローブを調整 nm。アプローチを開始する従事するボタンをクリックします。
  5. 試料の表面が明らかに見られるまでに近づくと、一度徐々 に振幅 Setpoint を最適化します。1 x 1 μ m スキャン サイズと 512 × 512 ピクセルに解像度を増加します。画像集録を開始する従事するボタンに続いてキャプチャ ボタンをクリックします。
    注:図 4の画像は、イメージングのこれらのサンプルを期待できる滑らかな背景を表示します。
  6. ヌクレオソームのサンプルを分析するには、AFM 計測器解析ソフトウェアを使用して撮影した画像を開きます。
    1. 多項式線減算または同様の機能を使用してイメージを平らにします。
    2. 最小値の最小値と最大値の最高値を反映するようにカラー テーブルを設定します。各画像のこれらの値のレコードをままに後の手順で必要になります。
      注: これらの値を使用しない場合の高さデータ不正確になります後におけるヌクレオソーム コアの断面積が等しいではなく、さまざまな高さの台地として表示されます。
    3. オリジナル サイズの .tiff イメージとしてイメージをエクスポートします。罫線またはスケール バーで画像を保存する任意のオプションを選択解除します。
    4. 輪郭線長測定解析ソフトウェアでイメージを開きます。
    5. X、y および z を設定イメージに合わせてスケールします。
    6. 内部の長さ校正として測定し、1 つの端から他に自由な DNA の輪郭の長さを記録します。このキャリブレーション係数のヒストグラムを生成し、正規 (ガウス) 分布に適合する測定値を使用します。ピーク中心を分割 (c) x 塩基対の基板の長さによって。
      注: この値は、イメージ特定する変換係数ナノメートルから DNA の基本ペアです。
    7. 測定し、(図 5 a) 一貫性を保つのため、コアの中心に腕の自由端から各ヌクレオソームの両方の腕の輪郭の長さを記録します。
    8. 2 つのコアの垂直ペアから半分の最大 (半値幅) 値で幅完全収集各ヌクレオソーム コア断面積測定 (図 5 b 2 つの半値幅測定の平均し、各ヌクレオソーム腕から結果値の 2 分の 1 を減算コアの中心に出入 DNA から測定の長さのために正しいことがないです腕の長さの一部
    9. 各アーム長さ DNA 塩基対のアームの長さを取得する計算されたキャリブレーション係数 (手順 4.5.6) で割ります。
    10. アンラップされた基板の総塩基対の長さからヌクレオソームの腕の合計を差し引くことによって DNA のエクステントを計算します。ヒストグラムとしてこれらの値をプロットし、平均のラップされた塩基対の DNA のヌクレオソームの人口を取得する正規 (ガウス) 分布のピークを合わせてください。
    11. 測定断面から平均ヌクレオソームの高さを計算します。これをヒストグラムとしてプロットし、ヌクレオソーム人口の高さを取得する正規 (ガウス) 分布のピークを合わせてください。

5 ヌクレオソーム ダイナミクスのコマの AFM イメージング

  1. チップ ホルダーの原子間力顕微鏡の先端をマウントします。プローブ約 0.1 N/m のバネ定数と 7-10 kHz の共振周波数を使用することができます (ここで使用される片の材料のリストを参照してください)。
  2. 両面テープを使用して磁気パックに APS 雲母の 1 × 1 cm 部分を接続し、AFM 計測器のパックをマウントします。
  3. 1 nM 濃度 10 mM HEPES pH 7.5 と 4 mM MgCl2を含む 0.22 μ m フィルター画像バッファーにヌクレオソームを希釈します。
  4. 預金希薄のヌクレオソームの 5-10 μ L 2 分リンスの雲母片の中央に蒸着サンプル画像バッファーの 20µL を 2 回。2 回目のすすぎ後表面上のバッファーをイメージングの液滴を維持します。
  5. 先端が 100 ~ 500 まで先端と表面へのアプローチを手動で検索する最上位のビューのカメラを使用して表面から μ m。
  6. 先端と表面との間のギャップを埋めるための追加画像バッファーを追加します。この例では、約 50 μ L 画像バッファーのギャップを埋めるために十分です。先端の共振ピークを見つけます。
  7. 表面にコンピューター制御アプローチを始めます。近づくと、興味の ~ 500 nm 領域を選択する 1-2 μ m 領域イメージングを開始します。選択したこのエリア、512 × 512 ピクセルにデータ集録の密度を調整します。
  8. セット ポイントの電圧を調整して画像の品質を改善するために振幅のパラメーターをドライブします。無料振幅 10 nm 以下 〜 2 Hz のスキャン速度は、品質の画像をキャプチャする使用ことができます。タイムラプス原子間力顕微鏡を使用してキャプチャ ヌクレオソーム ダイナミクスの例は図 6に示します。

6 ヌクレオソーム ダイナミクスの高速コマ撮り AFM イメージング

注: 以下のプロトコルは、安藤グループ (金沢県金沢大学) によって開発された HS AFM 計測器に提供されます。60

  1. 液体用 APS 雲母を準備します。
    1. ガラス棒をガラス棒 - スキャナーの接着剤を用いた AFM スキャナー ステージにアタッチ (材料の表を参照してください)。10 分以上のこのドライをしましょう。
    2. 大きな雲母シートからそれらを打つことによって ~0.1 mm 直径 1.5 mm の雲母の厚い円形部分を作る。HS AFM 雲母ガラス棒の接着剤を使用 (材料の表を参照) HS AFM とドライ、10 分以上そのままにガラス棒にこの雲母片を付ける。粘着テープを使用してテープにも劈開層が見られるまでの層を切断します。
    3. 99 μ dd H2O 500 μ M APS ソリューションにするために 50 ミリメートル APS 株式の 1 μ L を希釈します。新たに裂かれた雲母の表面にこのソリューションの 2.5 μ L を入金させ 30 分に匹敵します。
      注: 機能付与、表面の乾燥を防ぐため、50 mL の円錐形遠心チューブのキャップ フィルター紙の湿った部分でフィットでき、スキャナーの上に配置。APS 株式が希釈される原子間力顕微鏡で観察することができますレートのダイナミクスを制御する静的な画像よりも液体用 3 倍未満。
    4. いくつか 〜 3 μ L 洗口液を適用することによって dd H2O の 20 μ L で雲母をすすいでください。不織布ワイプ、雲母の端に配置することによって完全に次の各リンス水を削除します。最終すすぎの後表面に dd H2O の 〜 3 μ L を配置し、任意特異的バインドされた AP を削除する 5 分以上座らせてください。
  2. HS AFM ホルダーにプローブを配置し、上向きの先端と原子間力顕微鏡ステージ上ホルダーを配置します。Dd H ~ 100 μ L を使用してホルダー2O は、0.22 μ m フィルター ヌクレオソーム イメージングの 2 ~ 100 μ L リンス続いてバッファーをリンスには、10 mM HEPES pH 7.5 と 4 mM MgCl2が含まれています。
  3. 行われるリンス、バッファー、先端を水没をイメージング ヌクレオソームの ~ 100 μ L で商工会議所を埋めます。レーザーでヒットまでは、カンチレバーの位置を調整します。AP-マイカ バッファーをイメージング フィルターのヌクレオソームの 20 μ L でリンスあたり ~ 4 μ L を使用してすすいでください。
  4. 1 の最終ヌクレオソーム濃度のバッファーをイメージング フィルターのヌクレオソームの 250 μ L にヌクレオソーム アセンブリ株式の 1 μ L を希釈 nM。表面にこの希釈の 2.5 μ L を預金し、2 分で表面を洗うを座らせて 〜 ヌクレオソーム イメージングのバッファー 2 倍の 4 μ L。最終すすぎの後、バッファーをイメージングで覆われた表面を残します。
    注: 場合、表面はヌクレオソーム サンプルを入金後リンスではなく、表面が急速に混雑するように。
  5. サンプルがダウン顔、スキャナーとチップ ホルダーの上にサンプルを設定します。アプローチを開始するには、セット ポイントの振幅、自由振動の振幅は0に近いs自動アプローチ関数を使用します。
    注: 理想的には、s = 0.95 注意場合0、ただし、0の 82% で動作が十分に働くでしょう。
  6. 表面がよく追跡されているまでは、セット ポイントを調整します。
    注: ヌクレオソームのサンプルの原子間力顕微鏡の先端からエネルギーの伝達を最小限に抑えるためにカンチレバーの振幅小さく保たれるべき、振幅 1 の低最適な nm。
  7. 画像領域約 150 × 150 を設定 200 x 200 nm 〜 300 ms イメージング フレームごとのデータ集録レートと nm。
    注: このイメージのサイズは通常いくつかのヌクレオソームのダイナミクスを同時にキャプチャするための十分です。人口の少ない表面は、これらのパラメーターに対する変更を呼び出すことができます。推奨されるフレーム レートは、スライディングなど他 (代表結果以下のセクションを参照) の中で開梱をループ、ヌクレオソーム ダイナミクスをキャプチャするのに十分です。

7 時間経過原子間力顕微鏡を使用してキャプチャ ヌクレオソーム ダイナミクスの解析

  1. HS 原子間力顕微鏡データ型 (.asd) から .tiff 画像に画像を変換します。
    1. 背景がある均一なコントラストまで平面または行のいずれかの関数を使用して原子間力顕微鏡システムの解析ソフトウェアを使用して画像を平らにします。
    2. 画像のコントラスト (カラー スケール) を自動に設定します。
      注: コントラストは、プレゼンテーションの目的ではなく分析、手動で調整することができます。これにより、変換後のイメージで失われる高さ詳細。
    3. .Mov ファイルとして画像の選択範囲を保存します。スケール バーを選択解除し、保存する前にオプションの国境します。
      ノート: フレームに縮尺記号を持つ画像の分析を行わないでください。これらは、イメージのサイズを変更、虚偽の測定になります。
    4. .Mov ファイルを適切なソフトウェアを使用して tiff 画像に変換 (材料の表を参照してください)。.Mov ファイルを作成するときに使用したのと同じフレーム レートを変換に使用します。
  2. 腕の長さの輪郭測定のこの測定のできる測定ソフトウェアで画像を開いて (材料の表を参照) を入力します。
    1. それがキャプチャされた、それらを一致するように画像のサイズを設定します。
    2. ヌクレオソーム コアの中心に、アームの先端から各ヌクレオソーム腕の輪郭の長さを測定し、スプレッドシート (図 4 a) で測定を記録します。
    3. ヌクレオソームのラップを解除した後は、フレームにラップされていない DNA 基板の長さを測定します。ヌクレオソームの計算を包むために使用される nm/bp 比の映画の特定の校正の使用します。
    4. ヌクレオソームのコア 2 つの断面プロファイルと裸の DNA (図 4 b) の 2 つを収集します。
    5. 断面プロファイルを表計算ソフトにインポート、プロファイルのすべてのポイントから最小 z 値を減算することによってプロットを正規化します。
    6. 半値 (半値幅) 各断面の幅と高さを計算し、各フレームの 2 つのプロファイルの値を平均します。
  3. 半分を引く各ヌクレオソームの半値幅値の腕はプロットと共に腕の合計散布。
    1. フレーム内の DNA は、ヌクレオソームにラップ解除後 DNA の測定から平均輪郭線長を計算します。
    2. DNA 基板の塩基対の長さによって自由な DNA の平均コンターの長さで割って nm/bp キャリブレーション係数を決定します。5.12 のセクションで説明したようこの値を使用して各フレームのヌクレオソームの折り返しを計算します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

モノラル ヌクレオソーム最初、afm イメージング実験の連続希釈アセンブリ メソッド (図 1) を使用して作製した.準備のヌクレオソームは、不連続 SDS ページ (図 2) を使用してがチェックされたし。雲母表面は次に、APS は、高分解能観察 (図 3) の滑らかな背景を維持しながら表面のヌクレオソームをキャプチャを使用して官能基化。ヌクレオソームは APS 雲母上に堆積したし、その後静的 AFM イメージングの使用をイメージしました。アセンブリおよび沈着のコントロールとして H3 モノラル ヌクレオソーム調製し、, 静的な原子間力顕微鏡を使ってイメージ化します。H3 のモノラル ヌクレオソーム (図 4 a) のイメージ ヌクレオソーム人口のスナップショットが提供堆積、ヌクレオソームが正常に組み立てられていることを確認する前に瞬間が存在していた。2 nM ヌクレオソーム蒸着表面全体にヌクレオソームと DNA 粒子の均一な分布を提供, 非常にはほとんどないの叢生が認められた.

H3 コントロール アセンブリ成功と提示方法次にセントロメア ヌクレオソームの研究に適用しました。(図 4 b) このサンプルの静的 AFM イメージングでは、アセンブリが成功したことを明らかにしました。表面粒子密度におけるヌクレオソーム濃度の影響を示すためには、セントロメア ヌクレオソームが 1 で堆積した nM (図 4 b)、2 に比べて H3 用 nM (図 4 a)。これは H3 のサンプル約半分にセントロメア サンプルの減らされた表面粒子密度で起因しました。静的の AFM 像からモノラル ヌクレオソームの高さとターン数が特徴付けられた (図 5)。両方無料の DNA 腕と無料の DNA 腕の長さ間の角度は、個々 のヌクレオソームで DNA の数ターンを決定に使用されました。

バッファーのヌクレオソームのコマ撮りの AFM イメージングは、ヌクレオソーム (図 6) の全体的な自発的なアンラッピング動作を視覚化に使用されました。ヌクレオソームの腕とこのアンラッピング (図 6 B C) 中に各フレームで決定されるターン数で使用できる腕の輪郭の長さ間の角度を測定します。ヌクレオソームのターン数が減少すると、ヌクレオソーム コア ボリュームの対応する減少には、(図 6) はまた観察されます。高速コマ撮り AFM プローブ標準タイムラプス イメージングを使用して失われたより複雑なヌクレオソーム ダイナミクスに使われました。長い期間にわたってダイナミクスをキャプチャするこの手法の能力 ~ 1200 のフレームにわたって捕獲されたセントロメア ヌクレオソーム コア (図 7) の長距離輸送の可視化に不可欠であった。この手法も別 (図 8) に 1 つの DNA の基板からセントロメア ヌクレオソームコアのまれな転送をキャプチャで非常に重要だった。高速な画像取り込み (~ 300 ms/フレーム) を完了するいくつかのフレームだけかかったこの動的イベントの可視化を可能にしました。

表 1: 連続塩グラデーション ヌクレオソーム アセンブリで必要な試薬。各コンポーネントの一覧は、精製した DNA を含むおよび microfuge の管に追加されます。これは順番に試薬が水と、表に記載されてし、塩化ナトリウムを追加最初、続いて H2A/H2B ダイマーとヒストン四量体の最後に追加されるべきであります。折り曲げ済みヒストン octamers を使用する場合は、上記の四量体は同じ率で追加します。* それぞれのヒストン株のコンテンツ、NaCl のメモを取る、2 M でなければ決勝 [食塩] したがって、追加 5 M 塩化ナトリウムを調整します。 (材料の表を参照)。

Figure 1
図 1:マイクロ スケール ヌクレオソーム アセンブリに使用するシリンジ ポンプの概略図。アセンブリ混合物は、注射針の端と接触するように配置されます。希釈バッファーは NaCl の濃度が減少し、ヌクレオソーム アセンブリを促進アセンブリ混合物にシリンジ ポンプで配信します。この図は Stumme ディアーズらから適応です。30この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 組み立てのヌクレオソームの SDS-PAGE 。レーン 1 と 2 は、それぞれ H3 八量体およびヒストンのセントロメア アセンブリを含まれています。レーン 3 および 4 は、それぞれ組み立て H3 ヌクレオソームと組み立てのセントロメア ヌクレオソームを含まれています。車線で、ヒストンだけコントロールする組み立てのヌクレオソームの比較では、ヌクレオソームが正しく組み立てられたことを確認してください。各レーン上漫画の模式図は、ヒストン コンポーネントが存在を示します。この図は Stumme ディアーズらから適応です。30この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: APS を準備するプロセスの模式図がヌクレオソームの AFM イメージングの雲母を官能基化します。(A) 雲母 ~0.1 mm 厚の一枚は、裂かれる新鮮な両面を持っています。(B) 劈開雲母作品は速やかに APS ソリューションを含むキュベットに斜めに置かれた、30 分 (C) 次の APS 機能化ステップ間インキュベートに設定されて、APS 雲母作品は dd2 H でいっぱいキュベットに転送30 秒すすぎ O。APS 雲母 (D) の部分は、使用するまでキュベットに格納されます。  この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 原子間力顕微鏡の例 H3 と CNEP のヌクレオソームのイメージ。(A) H3 モノ-ヌクレオソーム APS 雲母、静的な原子間力顕微鏡を使用してキャプチャした上に堆積のサンプル画像。明るい各 blob は、麺のような武器として現われる並ぶ DNA 領域をヌクレオソームコア粒子です。長い麺のような機能は、ヒストン コアに関連付けられていない無料の DNA 粒子です。このイメージのない混雑にはほとんどの表面の間で一様分布を提供 2 nM ヌクレオソーム濃度は使用されました。(B) このヌクレオソーム サンプルが 1 で蒸着された nM 2 よりもはるかに少ない人口が、nM (A) で使用されます。これはヌクレオソームの希釈は、ヌクレオソームの表面密度に直接的な影響を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: 折り返しとヌクレオソーム粒子の高さを特徴付けるために使用分析をビジュアルに表現します。図 3 に示すような画像から (A) A 代表ヌクレオソーム粒子。各ヌクレオソーム腕の輪郭の長さは、コア (緑の点線) の中心に、アームの先端から測定されます。 ヌクレオソームの断面プロファイル (赤と青のライン) をプロットし、これらのカーブの高さから (B) に示すように曲線を生成、粒子の幅詳細を定めることができます。 (C) 回路図、各種ラップ、ヌクレオソームの状態です。DNA の腕、DNA の回転数とラップされた DNA の bp の間の角度を使用して各ラップされた状態 (D) が特徴です。スケール バー = 20 nm。この図は、Lyubchenkoらから適応24この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6 。コマ AFM の例画像ヌクレオソームの自発的なアンラッピングをキャプチャします。(A) A 一連のバッファーの連続的なスキャンによってキャプチャされたヌクレオソームの自発的なアンラッピングの連続の AFM イメージ。各フレームのサイズは 200 nm と画像 ~ 170 のレートでキャプチャされたフレーム毎秒。(B) ヌクレオソーム増加、(C) のアームの長さは、各フレームで進行して DNA の減少がヌクレオソーム アンラッピングのプロセスとして回る。(黒) 測定アームの長さやヌクレオソーム腕 (赤) の間の角度からこのターン数が決定することができます。ヌクレオソームの量の減少は (青いカーブ、右軸) を観察してもターン数が減少すると、.各フレームは 200 x 200 nm の。この図は、Lyubchenkoらから適応24この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7。長い画像集録時間の高速コマ撮り原子間力顕微鏡の高容量のデモA (A) セントロメア ヌクレオソーム コアの転流挙動を示すよりも 1200 のフレームから選択したイメージのギャラリー。〜 300 ミリ秒の速度で各イメージのキャプチャ/フレームします。(B) セントロメアのコアに DNA 基板の一方の端から輪郭の長さの測定は、この長い移行プロセスを特徴付けるために使用します。スケール バー = 25 nm。この図は Stumme ディアーズらから適応16 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8。高速コマ撮り原子間力顕微鏡を使用してキャプチャした動的ヌクレオソーム コア転送の例 (図 Stumme ディアーズらから適応16 (A) 選択したフレームを別に 1 つの DNA の基板からセントロメア ヌクレオソームコアへの自発的移行を示します。このプロセス起こった 〜 300 ミリ秒の速度で捕獲されたいくつかのフレーム内/フレームします。A (B) (A) に示すように、転送プロセスの模式図。スケール バー = 25 nm。この図は Stumme ディアーズらから適応16 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

上記で説明したプロトコルはむしろ簡単で、再現性の高い結果を提供しますが、いくつかの重要な問題を強調することができます。官能 AP 雲母は、信頼性と再現性のある結果を得るためキー基板です。APS マイカの高安定性は、画像処理基板を準備されている後少なくとも 2 週間使用できます使用を事前に準備することができますこの基板の重要な機能の 1 つです。59,61ただし、表面が破損するおそれ接着剤の蒸気で雲母金属パックのマウントに使用されます。したがって、プロトコル (セクション 2) で説明されているようにマウント雲母の両面テープタイプを使用することをお勧めします。場合接着剤の使用が必要な場合たとえば、液体の投射のための金属ディスクの雲母の取り付け用接着剤を使用しているユーザー セクション 6.1.3 HS AFM イメージングのサンプル準備のために記述されているものから変更する次の手順をお勧め.雲母は金属のディスクまたは他の固体材料に接着し、接着剤が固化した後に切断されます。接着剤の潜在的な蒸気を削除するアルゴンと雲母を爆破します。マイカはスコッチ テープで切断することができ、たて劈開雲母ストリップをカバーする APS 雲母作業ソリューション配置します。ソリューションは、雲母のストリップのサイズによって異なります。30 分間反応する AP を許可します。蒸発を抑えるウェット ペトリ皿で反応を実行します。次の手順を使用: ソーク研究所拭く紙と場所は、ペトリ皿の底。ウェット ワイプの 5 mm 厚のプラスチック製のディスクを置き、ペトリ皿の下部に水が付いている接触を避けるそれを集成マイカと金属の円盤を置きます。30 分後雲母/ディスクを取り外し、dd 水とピペット セクション 6.1.3 で前述雲母表面を徹底的に洗浄します。表面はサンプル成膜可能です。APS 濃度は作業 APS ソリューション (1: 300) セクション 2.2 で説明されている必要がありますが良い出発点 DNA 実験で調整する必要があります。説明されているプロトコル セクション 6.1.3 HS AFM によるヌクレオソームのイメージングのための手順が記載されて、APS (1: 100) の 3 倍の高濃度を使用しました。

説明されたプロトコルは、APS と雲母の機能化に基づいています。これは、最も堅牢な高い再現性で簡単な手順です。唯一の欠点は、APS、アミノプロピル silatrane は市販されていません。APS 合成の手順は簡単ですし、その合成のためのプロトコルは、詳しく説明します。59合成手順は、問題のある、市販の試薬は、aminopropyltriethoxy シラン (APTES) が雲母高機能化 (AP ・ マイカ) 使用できます。同じ紙 AP 雲母の準備のためのプロトコルを提供します APTES の蒸気を使用しています。手順は、テストされ、トポロジ的な各種 DNA 35,36,50,62,63とヌクレオソームを含む様々 な蛋白質・ DNA 複合体のイメージング用します。27,50,64 APS ・ マイカと同様に AP 雲母は数週間にわたって安定とバッチで事前に準備することができます。AP 雲母表面が APS 雲母のように滑らかではなくバッファー組成に緩衝液 pH 値が pH10、1 mM と 200 mM の NaCl のイオン強度までのサンプルを用意できますので。59,65 AP 雲母の使用の唯一の欠点は、アミノプロピル シランを加水分解し、このプロセスがかなり遅いことができる骨材を水で時間経過イメージ投射の間に表面に集計で組み立てるの可能性表面に識別、DNA のように高解像度の画像が得られます。35 silatrane 基の加水分解が非常に遅いので長期的な画像の中に表示されている集計はみられません26,35,56,66 , したがって、APS マイカ水でイメージングを採用される場合 AP 雲母と比較すると望ましい基板です。APTES を用いて再現性、試薬の蒸留が AP 雲母の準備のために強く推奨します。紙59APTES 蒸留するためのプロトコルを説明します。

原子間力顕微鏡、分子技術としてヌクレオソーム ナノモル範囲とそのヌクレオソームで濃度は自発的にそのような低濃度で切り離すこともできますで動作します。私たちのデータ25によると解離過程は数十分の原子間力顕微鏡の研究のサンプルが、蒸着の直前に準備する必要が示唆しているで発生します。3 [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio などいくつかの洗剤]-1-propanesulfonate (チャップス) ヌクレオソーム安定性を高めるは、ヌクレオソームは、いくつかの注文の大きさ25一生を向上しますが、洗剤の使用を行う必要がありますので注意。25で示した配列特異性の変化によるヌクレオソームの安定化を伴うこと、ので、このような使用してもヌクレオソームのシーケンスの Widom 601 テンプレートとして特定のモチーフ、結合の特異性なし、601 で組み立てシーケンス。

他の原子間力顕微鏡試料作製法を基準にして提案手法による重要な問題の数があります。まず、APS 雲母と AP マイカ基板が数週間にわたって安定しているとバッチで事前に準備することができます。表面が滑らかで、バッファー組成に鈍感ではなく緩衝液 pH 値が pH10、1 mM と 200 mM の NaCl のイオン強度までのサンプルを用意できますので。59,65既存のメソッドのどれも一致するこれらのプロパティ。第二に、原子間力顕微鏡の単一分子法と非常に少ないサンプルを求められます。記述されていたプロトコルは準備のナノスケール量で動作します。第三に、時間経過の afm による研究と HS 原子間力顕微鏡データ集録、生成し、大量のデータ セットを取得を特徴付けるに必要な時間のかなりの量があります。ここで説明した方法論は、原子間力顕微鏡画像の何百もの分析に適しています。

サンプルの準備方法、ヌクレオソーム型サンプルに限定されません。むしろそれはタンパク質-DNA 複合体のタイプに敏感ではないと既に DNA、例えば制限酵素67,68,69, 単一座礁させた DNA の特定の配列を認識番号蛋白質に適用されています。結合タンパク質44,45,56,70,71 DNA 複製47,72に関係する複雑な蛋白質システムと共に、組換え68,73。重要なは、HS-原子間力顕微鏡は、これらのシステムのダイナミクスに従うこれらのシステムに適用されています。 これらの研究は、ヌクレオソームの配列での提案としての特性に開発方法論を適用し、セントロメア アセンブリに動原体タンパク質 B としてこのようなセントロメアの特定蛋白質の役割 (CENP-B)、C (CENP-C) を解明することが可能と多くのがん33,34の開発での役割を理解します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

著者の貢献: YLL と MSD 設計プロジェクトMSD は、ヌクレオソームを組み立てられます。MSD と ZS は、AFM 実験とデータ解析を実行しました。すべての著者を書いて、原稿を編集します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

生化学、問題 143、AFM、コマ撮り、ヌクレオソーム、クロマチン、力学、構造、ヒストン、単一の分子、DNA、エピジェネティクス、イメージング
構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter