Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Summary

Nous présentons ici un protocole afin de caractériser les particules nucleosome à l’échelle de la molécule unique à l’aide de la microscopie à force atomique statiques et time-lapse (AFM) techniques d’imagerie. La méthode de la fonctionnalisation de surface décrite permet la capture de la structure et la dynamique des nucléosomes dans haute résolution à l’échelle nanométrique.

Abstract

La chromatine, qui est une longue chaîne de sous-unités nucléosome, est un système dynamique qui permet à ces procédés critiques comme la réplication de l’ADN et la transcription de prendre place dans les cellules eucaryotes. La dynamique des nucléosomes fournit l’accès à l’ADN par les mécanismes de réplication et de transcription et critique contribue aux mécanismes moléculaires qui sous-tendent les fonctions de la chromatine. Études de la molécule unique comme la microscopie à force atomique (AFM) d’imagerie ont largement contribué à notre compréhension actuelle du rôle de la structure du nucléosome et dynamique. Le protocole actuel décrit les étapes permettant aux techniques d’imagerie à haute résolution de AFM étudier les propriétés structurales et dynamiques des nucléosomes. Le protocole est illustré par les données d’AFM obtenues pour les nucleosomes centromère dans lequel histone H3 est remplacé par sa protéine homologue de centromère A (CENP-A). Le protocole commence par l’Assemblée des mono-nucléosomes en utilisant une méthode de dilution continue. La préparation du substrat mica fonctionnalisé avec aminopropyl silatrane (APS-mica) qui est utilisé pour l’imagerie du nucléosome est cruciale pour la visualisation de l’AFM des nucléosomes décrit et la procédure pour préparer le substrat est fournie. Nucléosomes déposés sur la surface APS-mica sont imagés tout d’abord à l’aide de AFM statique, qui capture un instantané de la population du nucléosome. L’analyse de ces images, on peuvent mesurer des paramètres tels que la taille de l’ADN enroulé autour des nucléosomes et ce processus est également détaillé. Le time-lapse AFM d’imagerie de procédure dans le liquide est décrite pour l’AFM de time-lapse à grande vitesse qui peut prendre plusieurs images de la dynamique des nucléosomes par seconde. Enfin, l’analyse de la dynamique de nucléosomes permettant la caractérisation quantitative des processus dynamiques est décrit et illustré.

Introduction

Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est très condensé et organisée dans des chromosomes. ¹ le premier niveau d’organisation de l’ADN au sein d’un chromosome est l’Assemblée des nucléosomes dans laquelle 147 bp d’ADN est étroitement enroulé autour d’un noyau d’octamère d’histones. ^{2 , 3} particules nucleosome assemblent sur une longue molécule d’ADN formant un tableau de la chromatine qui est ensuite organisé jusqu’à forme une unité très compacte du chromosome. ⁴ le démontage de la chromatine offre l’accès gratuit à l’ADN requis par les processus cellulaires essentielles telles que la réplication du génome et de transcription de gène, ce qui suggère que la chromatine est un système hautement dynamique. ^{5 , 6 , 7} comprendre les propriétés dynamiques de l’ADN à différents niveaux de la chromatine est crucial pour élucider les processus génétiques à l’échelle moléculaire, où les erreurs peuvent conduire à la mort cellulaire ou l’apparition de maladies comme le cancer. ⁸ une propriété de la chromatine de grande importance est la dynamique des nucléosomes. ^{9 , 10 , 11 , 12} la grande stabilité de ces particules a permis la caractérisation structurale de techniques cristallographiques. ² ces quel manque d’études sont déballer les détails dynamiques des nucléosomes tels que le mécanisme de l’ADN du noyau histones ; la voie dynamique qui est requise pour le processus de transcription et de réplication. ^{7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16} en outre, des protéines spéciales appelées facteurs de remodelage auraient dû être divulgués afin de faciliter le démontage de particules nucléosomique¹⁷; Toutefois, la dynamique intrinsèque des nucléosomes est le facteur déterminant dans ce processus qui contribue au processus de démontage complet. ^{14 , 16 , 18 , 19}

Techniques de molécules simples comme single-molecule fluorescence^19,20,21, piégeage optique (pincettes)^13,18,22,23 et AFM ^{10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26} ont grandement contribué à la compréhension de la dynamique des nucléosomes. Parmi ces méthodes, AFM bénéficie de plusieurs caractéristiques uniques et attrayantes. AFM permet de visualiser et de caractériser les nucléosomes individuels, mais aussi la plus longue de tableaux²⁷. Des images de l’AFM, des caractéristiques importantes de structure nucléosomique tels que la longueur de l’ADN enroulé autour du noyau de l’histone peuvent être mesuré ^10,14,26,28; un paramètre qui est au cœur de la caractérisation de la dynamique unwrapping nucléosome. Passé AFM études ont révélé des nucléosomes systèmes hautement dynamiques et que l’ADN peut spontanément déballer de l’histone base¹⁴. Le déballage spontanée de l’ADN de nucléosomes a été visualisée directement par AFM fonctionnant dans le mode Time-lapse quand l’imagerie est fait dans des solutions aqueuses ^14,26,29.

L’avènement de l’instrumentation d’AFM (HS-AFM) time-lapse à grande vitesse a permis de visualiser le processus de déroulement nucleosome à la milliseconde chronologique ^14,15,24. HS-AFM ^16,30 des études récentes des nucléosomes spécifiques centromère a révélé plusieurs nouvelles caractéristiques des nucléosomes comparées au type canonique. Nucléosomes centromère constituent d’un centromère, une petite partie du chromosome très importante pour le chromosome ségrégation³¹. À la différence des nucléosomes canoniques dans la chromatine en vrac, le noyau histones des nucléosomes centromère contient histone CENP-A au lieu de l’histone H3^32,,³³. À la suite de cette substitution d’histone, habillage de l’ADN dans les nucléosomes centromère est ~ 120 bp au lieu de la 147 ~ bp pour nucléosomes canoniques ; une différence qui peut conduire à des morphologies distinctes des centromères et des nucléosomes canoniques tableaux³⁴, ce qui suggère que la chromatine centromère subit une dynamique plus élevée par rapport à la plus grande partie un. La nouvelle dynamique affichée par nucléosomes centromère dans les études de^{30 16,}HS-AFM exemplifient l’occasion unique fournie par cette technique de molécules simples de visualiser directement les propriétés structurales et dynamiques de nucléosomes. Exemples de ces fonctionnalités seront brièvement examinés et commentés à la fin du livre. Ce progrès ont été réalisés grâce au développement de nouveaux protocoles d’imagerie AFM des nucléosomes ainsi que les modifications des méthodes existantes. Le protocole décrit ici vise à rendre accessible à tous ceux qui voudraient utiliser ces techniques dans leurs enquêtes de chromatine ces avances excitantes études de molécules simples AFM nucléosome. Plusieurs des techniques décrites sont appliquent aux problèmes au-delà de l’étude des nucléosomes et peuvent être utilisés pour les enquêtes sur les autres systèmes d’ADN d’intérêt et de protéine. Quelques exemples de ces applications se trouvent dans les publications^{35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49} et les perspectives d’études AFM divers systèmes biomoléculaires sont indiquées dans l’examen des^{29,50,51,53,54}.

Protocol

1. Dilution continu Assemblée des Mono-nucléosomes Produire et purifier un substrat d’ADN bp environ 400 qui contient un nucléosome Widom 601 décentré séquence de positionnement. 55Remarque : Pour limiter la formation non désirée des di-nucléosomes, chaque « bras » flanquant la séquence de positionnement ne doit pas dépasser 150 ~ bp. Utilisez le plasmide pGEM3Z-601 avec les amorces et amplifier l’ADN de substrat à l’aide de la PCR. Pour le substrat de …

Representative Results

Mono-nucléosomes ont été tout d’abord préparés pour AFM d’imagerie expériences utilisant une méthode de montage de dilution continue (Figure 1). Les nucléosomes préparés ont été ensuite vérifiées à l’aide de discontinu SDS-PAGE (Figure 2). Une surface de mica a été ensuite fonctionnalisée à l’aide d’APS, qui capte les nucléosomes à la surface tout en conservant un fond lisse pour l’imagerie à haute résolution (<strong class="xf…

Discussion

Le protocole décrit ci-dessus est assez simple et fournissent des résultats hautement reproductibles, bien que quelques questions importantes peuvent être soulignées. Fonctionnalisés APS-mica est un substrat clé permettant d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Une grande stabilité de APS-mica est l’une des caractéristiques importantes de ce substrat qui permet de préparer le substrat d’imagerie à l’avance pour une utilisation qui peut être utilisée au moins deux semaines après en cours …

Materials

Plasmid pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primers	IDT, Coralville, IA	Custom Order	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Catalog number for 200 units
PCR purification kit	Qiagen, Hilden, Germany	28104	Catalog number for 50 units
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Catalog number for 250 g
EDTA	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0010	Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	15-0311	Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Catalog number for 8 devices
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Catalog number for 25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Catalog number for 25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	Catalog number for 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	Catalog number for 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain	Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muscovite Block Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS)	Synthesized as described in 22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Catalog number for 25 g
Scotch Tape	Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging)	Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)	Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	Catalog number for 2 g tube
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)	Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
Compound FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
MultiMode Atomic Force Microscope	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan