JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

Abstract

Chromatine, oftewel een lange keten van nucleosoom subeenheden, is een dynamisch systeem dat voorziet in deze kritieke processen zoals DNA replicatie en transcriptie te nemen plaats in eukaryote cellen. De dynamiek van nucleosomes toegang biedt tot de DNA van replicatie en transcriptie machineries en kritisch bijdraagt aan de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de chromatine functies. Studies van de single-molecuul zoals atomaire kracht microscopie (AFM) imaging hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons huidige begrip van de rol van nucleosoom structuur en dynamiek. Het huidige protocol beschrijft de stappen waardoor hoge resolutie beeldvormingstechnieken van de AFM te bestuderen van de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Het protocol wordt geïllustreerd door de AFM gegevens die zijn verkregen voor de nucleosomes van de centromeer waarin H3 Histon wordt vervangen door haar tegenhanger centromeer eiwit een (RETOREN-A). Het protocol begint met de vergadering van mono-nucleosomes met behulp van een methode van continue verdunning. De voorbereiding van het mica substraat met aminopropyl silatrane (APS-mica) die wordt gebruikt voor de beeldvorming nucleosoom matiemaatschappij is van cruciaal belang voor de AFM visualisatie van nucleosomes beschreven en de procedure voor het voorbereiden van het substraat wordt verstrekt. Nucleosomes gestort op het oppervlak van de APS-mica zijn eerste beeld met behulp van statische AFM, die een momentopname van de nucleosoom bevolking vangt. Uit analyses van deze beelden, dergelijke parameters zoals de grootte van DNA gewikkeld rond de nucleosomes kunnen worden gemeten en dit proces is ook gedetailleerd. De time-lapse AFM imaging procedure in de vloeistof wordt beschreven voor de high-speed time-lapse AFM die verschillende frames kan vangen van nucleosoom dynamiek per seconde. Ten slotte is de analyse van de dynamiek van de nucleosoom waardoor de kwantitatieve karakterisering van de dynamische processen beschreven en geïllustreerd.

Introduction

In eukaryote cellen is DNA zeer verkorte en georganiseerd in de chromosomen. 1 het eerste niveau van de organisatie van het DNA in een chromosoom is de vergadering van de nucleosomes in welke 147 bp van DNA is strak gewikkeld rond een kern van Histon octamer. 2 , 3 nucleosoom deeltjes monteren op een lange DNA-molecuul vormen een chromatine-array die wordt dan georganiseerd tot een zeer compact chromosoom eenheid ontstaat. 4 de demontage van de chromatine geeft de toegang tot het DNA dat vereist is door kritische cellulaire processen zoals gene transcriptie en genoom replicatie, suggereert dat chromatine is een zeer dynamisch systeem gratis. 5 , 6 , 7 inzicht in de dynamische eigenschappen van DNA op verschillende niveaus van de chromatine is uitermate belangrijk voor het ophelderen van genetische processen op moleculair niveau waar fouten tot celdood of de ontwikkeling van ziekten zoals kanker leiden kunnen. 8 is een eigenschap van de chromatine van groot belang is de dynamiek van nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 de hoge stabiliteit van deze deeltjes is toegestaan voor de karakterisering van het structurele door kristallografische technieken. 2 wat deze studies ontbreken zijn de dynamische details van nucleosomes zoals het mechanisme van DNA uitpakken vanuit de kern van Histon; de dynamische route die is vereist voor replicatie en schrijffouten en andere processen. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 bovendien speciale eiwitten remodelleert factoren genoemd is gebleken om de demontage van nucleosomal deeltjes17; de intrinsieke dynamiek van nucleosomes is echter de kritieke factor in dit proces dat tot het gehele demontage proces bijdraagt. 14 , 16 , 18 , 19

Single-molecuul technieken zoals single-molecuul fluorescentie19,20,21, optische overlapping (pincet)13,18,22,23 en AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 zijn instrumentaal in het begrip van de dynamiek van nucleosomes. Tussen deze methoden, AFM profiteert van diverse unieke en aantrekkelijke functies. AFM maakt het mogelijk om te visualiseren en karakteriseren van individuele nucleosomes evenals de langere matrices27. AFM beelden, kunnen belangrijke kenmerken van nucleosoom structuur zoals de lengte van DNA de Histon kern gewikkeld worden gemeten 10,14,26,28; een parameter die centraal staat in de karakterisering van nucleosoom uitpakken dynamiek. Verleden AFM studies is nucleosomes zeer dynamische systemen en dat DNA spontaan vanuit de kern Histon14 uitpakken kuntgebleken. De spontane uitpakken van DNA van nucleosomes was direct gevisualiseerd door AFM actief zijn in de modus time-lapse wanneer de beeldvorming wordt gedaan in waterige oplossingen 14,26,29.

De komst van de snelle time-lapse instrumentatie van de AFM (HS-AFM) maakte het mogelijk om te visualiseren van het proces nucleosoom uitpakken op de milliseconde tijdschaal 14,15,24. Recente studies van de30 van HS-AFM 16,van centromeer specifieke nucleosomes geopenbaard verschillende nieuwe functies van de nucleosomes vergeleken met het canonieke type. Centromeer nucleosomes vormen van een centromeer, een klein deel van het chromosoom cruciaal voor chromosoom segregatie31. In tegenstelling tot canonieke nucleosomes in bulk chromatine bevat de kern Histon van centromeer nucleosomes RETOREN-A Histon in plaats van Histon H332,33. Als gevolg van deze substitutie Histon, is DNA inwikkeling in centromeer nucleosomes ~ 120 bp in plaats van de 147 ~ bp voor canonieke nucleosomes; een verschil dat tot verschillende morphologies van de centromeer en canonieke nucleosomes leiden kan arrays34, suggereren dat centromeer chromatine ondergaat hogere dynamiek in vergelijking met het grootste deel een. De nieuwe dynamiek weergegeven door centromeer nucleosomes HS-AFM16,30 studies illustreren de unieke kans geboden door de techniek van deze single-molecuul te visualiseren direct de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Voorbeelden van deze functies zal kort worden besproken en geïllustreerd aan het einde van het papier. Deze vooruitgang geboekt als gevolg van de ontwikkeling van nieuwe protocollen voor AFM beeldvorming van nucleosomes, alsmede de wijzigingen van bestaande methoden. Het doel van het protocol hier beschreven is vooruitgang te boeken deze spannende in single-molecuul AFM nucleosoom studies toegankelijk voor iedereen die graag gebruik maken van deze technieken in hun onderzoek van de chromatine. Veel van de beschreven technieken zijn van toepassing op problemen buiten de studie van nucleosomes en kunnen worden gebruikt voor onderzoek van de andere eiwitten en DNA systemen van belang. Een paar voorbeelden van dergelijke toepassingen kunnen worden gevonden in publicaties35,36,,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 en vooruitzichten van AFM studies verschillende biomoleculaire systemen worden gegeven in29,50,51,53,,54Beoordelingen.

Protocol

1. continu verdunning vergadering van Mono-nucleosomes Genereren en zuiveren van een ongeveer 400 bp DNA substraat dat een af-gecentreerde Widom 601 nucleosoom positionering van de reeks bevat. 55Opmerking: Als u wilt beperken de ongewenste vorming van di-nucleosomes, elke ‘arm’ flankerend de positionering volgorde mag niet meer dan ~ 150 bp. Gebruik van de plasmide pGEM3Z-601 samen met de ontworpen inleidingen en versterken van het substraat-DNA met PCR. Voor de 423 bp subst…

Representative Results

Mono-nucleosomes waren eerst voorbereid op AFM imaging experimenten met behulp van een continu verdunning vergadering methode (Figuur 1). De voorbereide nucleosomes werden vervolgens gecontroleerd met behulp van de discontinue SDS-pagina (Figuur 2). Een mica oppervlak werd vervolgens matiemaatschappij met APS, die nucleosomes op het oppervlak vangt met behoud van een goede achtergrond voor hoge resolutie afbeeldingen (Figuur 3). Nuc…

Discussion

Het protocol dat hierboven beschreven is vrij eenvoudig en bieden zeer reproduceerbare resultaten, hoewel een paar belangrijke kwesties kunnen worden benadrukt. Matiemaatschappij APS-mica is een belangrijk substraat voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Een hoge stabiliteit van APS-mica is een van de belangrijke kenmerken van dit substraat waarmee men het imaging substraat van tevoren gereedmaakt voor gebruik dat kan worden gebruikt ten minste twee weken na voorbereid. 59</s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Auteur bijdragen: YLL en MSD ontworpen het project; MSD gemonteerd nucleosomes. MSD en ZS uitgevoerd AFM experimenten en data analyses. Alle auteurs schreef en het manuscript bewerkt.

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. o. p. h. i. e. E., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Bioquímica. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. e. e. t. a. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Chellappan, S. P. . Chromatin Protocols. , 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Bioquímica. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Bioquímica. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L., Meyers, R. . Encyclopedia of Analytical Chemistry. , 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L., Lyubchenko, Y. L. . Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. , 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. “Antiparallel” DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Bioquímica. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Bioquímica. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Bioquímica. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L., Taatjes, D. J., Roth, J. . Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. , 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T., Braga, P. C., Ricci, D. . Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. , 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. . Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Bioquímica. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Bioquímica. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Bioquímica. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Bioquímica. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Bioquímica. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Keywords: Atomic Force MicroscopyNucleosome StructureSingle-molecule ImagingProtein-DNA ComplexesAmyloid AggregatesAlzheimer’s DiseaseParkinson’s DiseaseMica Surface PreparationAPS ModificationStatic AFM Imaging
check_url/pt/58820?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image