JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיון חלקיקים נוקלאוזום ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי סטטי ו בצילום מואץ (AFM) טכניקות הדמיה. שיטת functionalization פני השטח המתואר מאפשרת לכידתו של המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים ב ברזולוציה גבוהה ב הננומטרי.

Abstract

כרומטין, אשר שרשרת ארוכה של נוקלאוזום subunits, היא מערכת דינמית המאפשרת עבור תהליכים קריטיים כאלה כמו שכפול ה-DNA, תמלול לקחת למקם את התאים האיקריוטים. הדינמיקה של נוקליאוזומים מספקת גישה אל ה-DNA על ידי שעתוק ושכפול machineries, ותורמת באופן ביקורתי המנגנונים המולקולריים שבבסיס כרומטין פונקציות. מולקולה בודדת מחקרים כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הדמיה תרמו באופן משמעותי את ההבנה הנוכחית שלנו התפקיד של מבנה נוקלאוזום ואת הדינמיקה. בפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הפעלת טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה של AFM ללמוד את המאפיינים דינמי מבניים של נוקליאוזומים. הפרוטוקול מודגם על ידי AFM נתונים שהושגו עבור נוקליאוזומים צנטרומר שבו H3 היסטון מוחלף עם עמיתו שלה, צנטרומר חלבונים (CENP-A). הפרוטוקול מתחיל עם ההרכבה של מונו-נוקליאוזומים באמצעות שיטה דילול רציפה. הכנת המצע נציץ functionalized עם aminopropyl silatrane (APS-מיכה) המשמשת עבור ההדמיה נוקלאוזום הוא קריטי עבור הפריט החזותי AFM של נוקליאוזומים תיאר וסיפק ההליך כדי להכין את המצע. נוקליאוזומים שהופקדו על פני השטח APS-מיכה הם קודם עם תמונה באמצעות AFM סטטיים, אשר לוכדת תמונה של האוכלוסייה נוקלאוזום. מניתוחי בתמונות אלו, ניתן למדוד פרמטרים כגון כמו הגודל של DNA העוטפת את נוקליאוזומים, תהליך זה גם מפורט. AFM זמן לשגות הדמיה הליך בנוזל מתואר עבור AFM בצילום מואץ במהירות גבוהה כי יכול ללכוד מספר פריימים של נוקלאוזום דינמיקה לשניה. לבסוף, הניתוח של דינמיקה נוקלאוזום המאפשרים אפיון כמותי תהליכים דינאמיים תיאר, מאויר.

Introduction

התאים האיקריוטים, ה-DNA הוא מאוד מרוכז ומאורגן לתוך כרומוזומים. 1 הרמה הראשונה של ארגון ה-DNA בתוך כרומוזום הוא ההרכבה של נוקליאוזומים ב 147 אילו bp של ה-DNA הוא מתאמץ יותר סביב ליבה octamer היסטון. 2 , 3 נוקלאוזום חלקיקים להרכיב על מולקולה DNA ארוך יוצרים מערך כרומטין אשר מאורגן אז עד יחידה קומפקטית מאוד כרומוזום נוצר. 4 פירוק של כרומטין מאפשר גישה חינם דנ א הנדרש על-ידי תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול שעתוק ו גנום של ג’ין, רומז שכרומטין הזה הוא מערכת דינמי מאוד. 5 , 6 , 7 להבנת מאפייני ה-DNA ברמות שונות של כרומטין דינמי הוא חשוב ביותר עבור שחקרתי תהליכים גנטיים ברמה המולקולרית בו טעויות עלולות להוביל מוות של תאים או ההתפתחות של מחלות כמו סרטן. 8 מאפיין כרומטין חשיבות רבה הוא הדינמיקה של נוקליאוזומים. 9 , 10 , 11 , 12 ליציבות גבוהה של חלקיקים אלה אפשרה עבור אפיון מבניים על-ידי טכניקות לחקר הגבישים. 2 . איזה חוסר מחקרים אלה הם הפרטים דינמי של נוקליאוזומים כגון מנגנון ה-DNA הסרת העטיפה מן הליבה היסטון; מסלול דינמי אשר נדרשת עבור תהליכי שעתוק ושכפול. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 . בנוסף, חלבונים מיוחדים כינה גורמים שיפוץ הוכחו להקל את פירוק של חלקיקים nucleosomal17; אולם, הדינמיקה הפנימית של נוקליאוזומים הוא הגורם הקריטי בתהליך זה תורם לתהליך פירוק כולו. 14 , 16 , 18 , 19

מולקולה בודדת טכניקות כגון מולקולה בודדת פלורסצנטיות19,20,21,22,18,13,אופטי השמנה (פינצטה)23 ו AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 סייעו להבין את הדינמיקה של נוקליאוזומים. בין השיטות, נהנה AFM מספר תכונות ייחודי ואטרקטיבי. AFM מאפשר לנו להמחיש ולאפיין נוקליאוזומים בודדים, כמו גם את מערכי עוד27. AFM תמונות, המאפיינים החשובים של נוקלאוזום מבנה כגון אורך DNA סביב ליבת היסטון יכול להיות נמדדו 10,14,26,28; פרמטר זה הוא מרכזי האפיון של דינמיקה unwrapping נוקלאוזום. מעבר AFM מחקרים גילו נוקליאוזומים להיות דינמי מאוד ומערכות ה-DNA תוכל לפתוח באופן ספונטני מן הליבה היסטון14. ספונטנית הסרת העטיפה של ה-DNA של נוקליאוזומים היה דמיינו ישירות על ידי AFM לפעול במצב זמן לשגות כאשר ההדמיה נעשית פתרונות מימית 14,26,29.

כניסתו של מכשור מיקרוסקופ כוח אטומי (HS-AFM) במהירות גבוהה זמן לשגות אפשרו להמחיש את התהליך unwrapping נוקלאוזום אלפיות השנייה סרגל זמן 14,15,24. HS-AFM 16,30 המחקרים האחרונים נוקליאוזומים ספציפי צנטרומר גילה מספר תכונות הרומן של נוקליאוזומים לעומת הסוג הקנוני. צנטרומר נוקליאוזומים מהווים של צנטרומר, חלק קטן של כרומוזום חשוב ביותר עבור כרומוזום סגרגציה31. בניגוד נוקליאוזומים הקנוני של כרומטין בתפזורת, ליבת היסטון צנטרומר נוקליאוזומים מכיל CENP-A היסטון במקום היסטון H332,33. החלפה זו היסטון, גלישת ה-DNA של נוקליאוזומים צנטרומר היא ~ 120 bp במקום 147 ~ bp נוקליאוזומים הקנוני; הבדל זה יכול להוביל מורפולוגיות שונות של צנטרומר, נוקליאוזומים הקנוני מערכים34, רומז שכרומטין צנטרומר הזה עובר dynamics גבוה יותר לעומת הנפח אחד. הדינמיקות הרומן מוצג על ידי צנטרומר נוקליאוזומים במחקרים30 16,HS-AFM להדגים הזדמנות ייחודית שסופקו על-ידי טכניקה זו מולקולה בודדת ישירות להמחיש את המאפיינים דינמי מבניים של נוקליאוזומים. דוגמאות לתכונות ניתן בקצרה שנדונו ואת מאויר בסוף העיתון. התקדמות זו נעשתה עקב ההתפתחות של פרוטוקולים הרומן AFM הדמיה של נוקליאוזומים, כמו גם את השינויים של שיטות קיימות. המטרה של הפרוטוקול המתואר כאן היא להפוך את ההתפתחויות הללו מרגש במחקרים נוקלאוזום AFM מולקולה בודדת נגישה לכל מי שרוצה לנצל את טכניקות האלה החקירות שלהם כרומטין. רבים אחת מהטכניקות שתוארו החלות על בעיות מעבר המחקר של נוקליאוזומים, יכול לשמש עבור חקירות אחרות חלבון ומערכות ה-DNA של עניין. ניתן למצוא כמה דוגמאות של יישומים כגון פרסומים35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 ועתידה של AFM מחקרים של מערכות למערכות ביולוגיות שונות ניתנות ב דעת29,50,51,53,54.

Protocol

1. רציף דילול הרכבה של מונו-נוקליאוזומים לייצר ולטהר המצע דנ א כ- 400 של bp המכיל את ממורכז ווידום 601 נוקלאוזום מיצוב רצף. 55הערה: כדי להגביל את היווצרות di-נוקליאוזומים לא רצויים, כל ‘זרוע’ איגוף הרצף המיקום לא יעלה על ~ 150 bp. השתמש פלסמיד pGEM3Z-601 יחד עם תחל תוכנן ומגבירים את ה…

Representative Results

מונו-נוקליאוזומים שהוכנו קודם עבור AFM הדמיה ניסויים באמצעות שיטת הרכבה רציפה דילול (איור 1). נוקליאוזומים מוכן ואז נבדקו באמצעות מרחביות מקוטע-דף (איור 2). משטח מישה היה functionalized הבא באמצעות APS, אשר לוכדת נוקליאוזומים על פני השטח תוך שמירה על רקע חלקה עבור הדמי?…

Discussion

הפרוטוקול המתואר לעיל היא פשוטה למדי, מספקים תוצאות מאוד לשחזור, למרות כמה נושאים חשובים יכול להדגיש. Functionalized APS-מיכה הוא מצע מפתח להשגת תוצאות אמין לשחזור. יציבות גבוהה של APS-מיכה היא אחת התכונות החשובות של סובסטרט זה המאפשר אחד כדי להכין את המצע הדמיה מראש לשימוש שיכול לשמש לפחות שבועיים ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחבר תרומות: YLL ו- MSD תוכנן הפרויקט; MSD התאספו נוקליאוזומים. MSD, נמנום לבצע ניתוחים ניסויים ונתוני AFM. כל המחברים כתב וערך את כתב היד.

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. o. p. h. i. e. E., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Bioquímica. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. e. e. t. a. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Chellappan, S. P. . Chromatin Protocols. , 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Bioquímica. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Bioquímica. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L., Meyers, R. . Encyclopedia of Analytical Chemistry. , 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L., Lyubchenko, Y. L. . Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. , 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. “Antiparallel” DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Bioquímica. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Bioquímica. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Bioquímica. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L., Taatjes, D. J., Roth, J. . Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. , 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T., Braga, P. C., Ricci, D. . Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. , 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. . Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Bioquímica. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Bioquímica. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Bioquímica. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Bioquímica. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Bioquímica. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Keywords: Atomic Force MicroscopyNucleosome StructureSingle-molecule ImagingProtein-DNA ComplexesAmyloid AggregatesAlzheimer’s DiseaseParkinson’s DiseaseMica Surface PreparationAPS ModificationStatic AFM Imaging
check_url/pt/58820?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image