Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel
Summary
Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen “Röhren” und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.
Abstract
Zerebralen Arterien und ihre jeweiligen Mikrozirkulation liefern Sauerstoff und Nährstoffe an das Gehirn über Blut Durchflussregulierung. Endothelzellen säumen das Lumen der Blutgefäße und Befehl Änderungen im vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen. Primäre Endothel-abhängige Signalwege der Hyperpolarisation des Membranpotentials (Vm) und Stickoxid-arbeiten in der Regel parallel zur Vermittlung Vasodilatation und steigern somit die Durchblutung. Obwohl integrale zur Koordinierung der Vasodilatation über mehrere Millimeter der vaskulären Länge wurden Bestandteile der Endothel-derived Hyperpolarisation (EDH) historisch schwierig zu messen. Diese Komponenten des EDH beinhalten intrazellulären Ca2 + [Ca2 +]ich erhöht und anschließende Aktivierung von klein – und Mittelstufe Leitwert Ca2 +-aktiviert K+ (SKCa/IKCa) Kanäle.
Hier präsentieren wir Ihnen eine vereinfachte Darstellung der Isolation des frischen Endothel von Maus zerebralen Arterien; gleichzeitige Messung von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.; und eine kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Hintere Hirnarterien aus dem Kreis von Willis entfernt die hinteren kommunizieren und die Kameraausrüstung Arterien frei. Enzymatische Verdauung von gereinigten hinteren zerebralen arteriellen Segmente und anschließenden Verreibung erleichtert die Entfernung der Adventitia, perivaskuläre Nerven und glatten Muskelzellen. Resultierende hintere zerebrale arterielle Endothelzellen “Röhren” sind dann unter dem Mikroskop gesichert und mit einer Kamera, Photomultiplier Tube, und ein bis zwei Stromzähler unter kontinuierlicher Superfusion untersucht. Gemeinsam kann diese Methode gleichzeitig Änderungen in Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm in diskreten zellulären lagen, neben der Verbreitung des EDH durch Lücke Kreuzungen bis zu Millimeter Abstand entlang der intakten messen Endothel. Diese Methode wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zugrunde liegenden Blut fließen Regulationsmechanismen im normalen und kranken Gehirn endothelialen Gehirnfunktionen ergeben.
Introduction
Blutfluss im Gehirn wird durch die Koordination der Vasodilatation bei zerebralen Arterien und Arteriolen in vaskulären Netzwerken1geregelt. Endothelzellen Futter zerebralen Arterien Befehl Widerstandsänderungen vaskulären Durchmesser je nach Bedarf für die metabolische Nachfrage von Neuronen1,2,3. Insbesondere während der Endothel-derived Hyperpolarisation (allgemein bekannt als EDH) intrazelluläre Ca2 + ([Ca2 +]ich) und elektrische Signalisierung in Endothelzellen koordinieren Vasodilatation unter den Endothelzellen und ihre umgebenden glatten Muskelzellen durch Gap Junctions für arterielle Entspannung4. Physiologische Einleitung des EDH beinhaltet nacheinander Stimulierung des G-Q-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), eine Zunahme [Ca2 +]ichund Aktivierung von Endothelzellen kleine und Intermediate-Ca2 +-aktiviert K+ (SKCa/IKCa) Kanäle zu zerebralen Endothelzellen Membran potenzielle (Vm)5,6,7hyperpolarize. So ist das innige Verhältnis von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm Blut Durchflussregulierung integraler Bestandteil und unverzichtbar für Kardio- und zerebrovaskuläre Funktion6,8. In der breiteren Literatur haben zahlreiche Studien die Assoziation von vaskulären endothelialen Dysfunktion mit der Entwicklung von chronischen Krankheiten (z.B. Bluthochdruck, Diabetes, Herzinsuffizienz, koronare Herzkrankheit, chronische Niereninsuffizienz, berichtet. periphere Herzkrankheit)9,10, was die Bedeutung des Studiums Endothelfunktion in physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Vaskulären Endothel ist ein wesentlicher Bestandteil für die Produktion von Hyperpolarisation, Vasodilatation und Gewebedurchblutung und somit Prüfung seiner nativen zellulären Eigenschaften entscheidend. Als eine allgemeine Studienmodell Vorbereitung des arteriellen endothelial Rohr Mausmodells vor Skelettmuskulatur11,12, Darm13, Lunge14, und vor kurzem für das Gehirn6erschienen. Studien zur gleichzeitigen [Ca2 +]ich und Vm Messungen sind insbesondere für skelettartigen Muskel arteriellen Endothel15,16 , sowie Lymphgefäßsystem Endothel17erschienen. Neben Primärstudien unter Verwendung des endothelialen Rohr Ansatzes kann ein umfassender Überblick über die vor- und Nachteile8 konsultiert werden, um festzustellen, ob diese experimentelle Werkzeug für eine spezifische Studie geeignet ist. Kurz gesagt, ein Vorteil ist, dass die physiologische Schlüsselkomponenten der endothelial Zelle Funktion beibehalten werden (z. B., Ca2 + Zustrom und intrazellulären freilassen, Hyperpolarisation der Vm bis das Nernst-Potenzial für K+ über SKCa/IKCa Aktivierung und endotheliale interzellulären Kopplung über Lücke Kreuzungen) ohne Störfaktoren wie perivaskuläre Nerven Input, glatte Muskulatur Voltage-gated Kanal Funktion und Kontraktilität, Zirkulation von Blut und hormonelle Einflüsse8. Im Gegensatz dazu häufig verwendete Zelle Kultur Ansätze einzuführen erhebliche Veränderungen in der Morphologie18 und Ionen-Kanal Ausdruck19 in einer Weise, die Vergleiche auf physiologische Beobachtungen bestimmt ex Vivo stark verschleiern kann oder in Vivo. Einschränkungen umfassen eine mangelnde Integration mit anderen wesentlichen Komponenten für die Regulierung der Durchblutung, wie glatte Muskulatur und eingeschränkte Flexibilität in einem experimentellen Zeitplan, wie dieses Modell optimal innerhalb von 4 h der intakten Kreislauf Segment isoliert getestet wird vom Tier.
Gebäude aus einem vorherigen video Protokoll verfasst von Socha und Segal12 und experimentellen Entwicklungen in der interim6,15,16, zeigen wir Ihnen hiermit die Isolation der frischen Endothel von hinteren Hirnarterien und gleichzeitige Messungen von Endothelzellen [Ca2 +]ich und Vm mit Fura-2 Photometrie und intrazellulären scharfe Elektroden bzw.. Darüber hinaus beinhaltet dieses Experiment kontinuierliche Superfusion von Salzlösungen und pharmakologische Wirkstoffe unter physiologischen Bedingungen (pH 7.4, 37 ° C). Wir entschieden uns für die hinteren zerebralen Arterie wie es isolierte Endothel mit der strukturellen Integrität (Zellen über Gap Junctions verbunden) und ausreichend Abmessungen (Breite ≥50 µm, Länge ≥300 µm) für Intra- und interzellulären Signal entlang und unter ergibt Endothelzellen. Darüber hinaus Studien der Nager hinteren zerebralen Arterie werden im Wesentlichen in der Literatur dargestellt und umfassen die Prüfung der grundlegenden endotheliale Signalisierung Mechanismen, vaskuläre Entwicklung/Altern und Pathologie20, 21 , 22. Diese experimentelle Anwendung wird voraussichtlich eine Hochdurchsatz-Analyse der zerebralen Endothelfunktion (und Dysfunktion) führen und ermöglicht dadurch erhebliche Fortschritte im Verständnis der Blut-Durchfluss-Verordnung in der gesamten Altern und die Entwicklung der Neurodegenerative Erkrankung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angesichts der jüngsten Entwicklungen6,15,16,17zeigen wir nun die Methode zur Isolierung Maus zerebralen arteriellen Endothel in Vorbereitung für die gleichzeitige Messung von [Ca2 +] i und Vm zugrunde liegenden EDH konsequent für ~ 2 h bei 37 ° C. Obwohl es technisch schwierig ist, messen wir Zell-zu-Zell-Kupplung sowie (siehe Referenz6</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Charles Hewitt für ausgezeichnete technische Unterstützung beim Aufbau, Ausrüstung und Zubehör für die aktuellen Protokolle erforderlich. Wir danken Dr. Sean M. Wilson und Christopher G. Wilson aus dem ETA-Zentrum für perinatale Biologie, für die uns mit einer zusätzlichen inversen Mikroskop und Elektrometer, bzw.. Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant R00-AG047198 (EJB) und Loma Linda University School of Medicine neue Fakultät für Start-up-Fonds unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
Referências
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