מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע
Summary
המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל “צינורות” ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.
Abstract
העורקים המוחיים ו microcirculation בהתאמה שלהם לספק חמצן וחומרים מזינים המוח דרך הדם לזרום ברגולציה. תאי אנדותל קו לומן של כלי דם ושינויים הפקודה קוטר כלי הדם לפי הצורך כדי בדרישה המטבולית של נוירונים. תלויי-אנדותל העיקרי איתות המסלולים של hyperpolarization של תחמוצת החנקן ו קרומית אפשרית (Vm) בדרך כלל פועלים במקביל כדי לתווך vasodilation ובכך להגביר את זרימת הדם. אמנם חלק בלתי נפרד תיאום vasodilation מעל מספר מ מ אורך כלי הדם, רכיבים של אנדותל, נגזר hyperpolarization (EDH) היה מבחינה היסטורית קשה למדוד. רכיבים אלה של EDH כרוכה תאיים Ca2 + [Ca2 +]אני מגדילה והפעלה עוקבות של קטן – ו ביניים מוליכות Ca2 +-מופעל K+ (SKCaגבירותייCa) ערוצים.
כאן, אנו מציגים דוגמה מפושטת של הבידוד של אנדותל טריים מן העורקים המוחיים העכבר; מדידות סימולטני של אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה; של superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). העורקים המוחיים האחורי של המעגל של וויליס יוסרו חינם של תקשורת האחורי, העורקים למפרצת. עיכול אנזימטי של נקי האחורי מקטעי עורקי המוח, trituration הבאים מקלה על הסרת adventitia, perivascular העצבים ותאי שריר חלק. וכתוצאה מכך האחורי מוחית עורקית אנדותל “צינורות” ואז מאובטחים תחת מיקרוסקופ ובחן באמצעות מצלמה, האופטיקה צינור, 1 ו- 2 electrometers תחת superfusion מתמשך. באופן קולקטיבי, בשיטה זו ניתן למדוד בו זמנית לשינויים אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm במיקומים הסלולר דיסקרטית, בנוסף הפצת EDH דרך הפער צמתי עד מילימטר במרחקים לאורך ללא פגע אנדותל. שיטה זו צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של הפונקציות אנדותל מוחי שבבסיס מנגנוני ויסות זרימת דם במוח רגיל וחולים.
Introduction
זרימת הדם ברחבי המוח מוסדר על ידי התיאום של vasodilation בין העורקים המוחיים רבים רשתות כלי דם1. תאי אנדותל רירית מוחי התנגדות העורקים פקודה משתנה קוטר כלי הדם לפי הצורך לפגוש את הדרישה המטבולית של נוירונים1,2,3. בפרט, במהלך hyperpolarization נגזר אנדותל (הידוע בכינויו EDH), Ca תאיים2 + ([Ca2 +]אני) ההספק ואת האותות חשמליים, תאי אנדותל vasodilation לתאם בין תאי אנדותל שלהם תאי שריר חלק שמסביב דרך צמתים הפער עבור הרפיה עורקים4. חניכה פיזיולוגיים של EDH כרוכה ברצף גירוי של Gq-בשילוב קולטנים (GPCRs), עלייה [Ca2 +]אני, והפעלה של אנדותל קטן – ו ביניים-קה2 +-מופעל K+ (SKCaגבירותייCa) ערוצים hyperpolarize מוחי ממברנה אנדותל פוטנציאליים (Vm)5,6,7. לכן, הקשר האינטימי של אנדותל [Ca2 +]אני ו- Vm הוא חלק בלתי נפרד ויסות זרימת דם והכרחי cardio -, פונקציה כשאבדן6,8. בכל הספרות רחבה יותר, מחקרים רבים דיווחו על איגוד בתפקוד אנדותל כלי הדם עם התפתחותן של מחלות כרוניות (כגון: יתר לחץ דם, סוכרת, אי ספיקת לב, מחלת עורקים כללית, אי ספיקת כליות כרונית, מחלת עורקים היקפיים)9,10, המציין את המשמעות של הלומדים פונקציה אנדותל בתנאים פיזיולוגיים, כמו גם פתולוגי.
אנדותל כלי הדם הינו חיוני להצלחת תהליך הייצור של hyperpolarization, vasodilation רקמות זלוף, לפיכך, בחינת תכונותיו הסלולר מקורית היא קריטית. כמודל כללי מחקר, הכנת דגם צינור אנדותל עורקי העכבר שפורסם לפני על שרירי השלד11,12, הבטן13, ריאות14, ועל לאחרונה את המוח6. מחקרים של סימולטני [Ca2 +]אני ומדידות Vm בפרט פורסמו שרירי השלד אנדותל עורקי15,16 , כמו גם כלי הלימפה אנדותל17. בנוסף ראשי לימודי ניצול הגישה צינור אנדותל, סקירה מקיפה של יתרונות וחסרונות8 ניתן להתייעץ עם כדי לקבוע אם כלי ניסיוני זה מתאים למחקר ספציפי. בקצרה, יתרון זה רכיבי מפתח פיזיולוגיים של תפקוד תאי אנדותל נשמרות (למשל, Ca2 + זרם ושחרור תאיים, hyperpolarization של Vm עד פוטנציאל נרנסט עבור K+ ויה SKCaגבירותייCa הפעלה, והצמתים אנדותל צימוד המערכת באמצעות הפער) ללא בלבול גורמים כגון קלט עצבי perivascular, הפונקציה ערוץ ממותגת מתח שריר חלק contractility, מחזור הדם ואת השפעות הורמונליות8. לעומת זאת, גישות התרבות התא נפוץ להציג שינויים משמעותיים מורפולוגיה18 ויון ערוץ ביטוי19 בצורה מאוד יכול המאפילים על השוואות אל תצפיות פיזיולוגיים נקבע ex-vivo או אין ויוו. מגבלות לכלול חוסר אינטגרציה עם רכיבים חיוניים אחרים כדי לווסת את זרימת הדם, כגון שריר חלק וגמישות מוגבלת, לוח זמנים ניסיוני של מודל זה נבדק בצורה אופטימלית תוך 4 שעות של בידוד קטע כלי הדם ללא פגע מהחיה.
בניין פרוטוקול וידאו קודמים שנכתבו על ידי Socha, סגל12 התפתחויות ניסיוני ב ביניים6,15,16, נדגים בזאת את ניתוקה של אנדותל צח מ העורקים המוחיים האחורי ומדידות סימולטני של אנדותל [Ca2 +]אני ו Vm באמצעות Fura-2 photometry ואלקטרודות חד תאיים, בהתאמה. בנוסף, ניסוי זה כרוך superfusion רציפה של פתרונות מלח וסוכני תרופתי במהלך בתנאים פיזיולוגיים (pH 7.4, 37 ° C). בחרנו את עורק המוח האחורי, כפי שהיא נושאת אנדותל מבודד עם שלמות מבנית (תאים מצמידים דרך צמתים הפער), מספיק מידות (רוחב ≥50 מיקרומטר, אורך ≥300 מיקרומטר) לשכנוע אינטרה – והאיתות המערכת לאורך ובקרב תאי אנדותל. בנוסף, מחקרים של עורק המוח האחורי מכרסם מיוצגים באופן משמעותי בספרות ולהכיל בתוכו בחינת יסוד מנגנוני איתות אנדותל, פיתוח כלי דם/הזדקנות, פתולוגיה20, 21 , 22. יישום ניסיוני זה צפוי להניב ניתוח תפוקה גבוהה של מוחי אנדותל (ותפקוד לקוי), ובכך יאפשר התקדמות משמעותית ההבנה של תקנה זרימת דם בכל רחבי הזדקנות, התפתחות מחלות ניווניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
לאור האחרונות התפתחויות6,15,16,17, נדגים כעת את השיטה כדי לבודד את העכבר אנדותל עורקי מוחין לקראת מדידה סימולטני של [Ca2 +] אני ו- Vm שבבסיס EDH בעקביות על ~ 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. למרות שטכנית קשה, אנו יכולים למדוד-?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים צ’ארלס יואיט לסיוע טכני מעולה בזמן הקמת ציוד ואספקה הדרושים עבור הפרוטוקולים הנוכחי. אנו מודים ד”ר שון וילסון ו כריסטופר וילסון, מהמרכז LLU על ביולוגיה הלידה, על מתן אותנו עם מיקרוסקופ הפוכה נוספים ו אלקטרומטר, בהתאמה. מחקר זה היא נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט R00-AG047198 (EJB), לומה לינדה הספר לרפואה של אוניברסיטת סגל חדש ראשונית. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
Referências
- Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
- Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
- Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
- Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
- Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
- Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
- Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
- Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
- Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
- Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
- Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
- Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
- Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
- Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer’s disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).
