Ein Protokoll für die Zubereitung von Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) (poly(PFPA)) gepfropft Kieselsäure Perlen wird vorgestellt. Die poly(PFPA) funktionalisierten Oberfläche ist dann mit Antikörper immobilisiert und die Protein-Trennung durch Immunopräzipitation erfolgreich eingesetzt.
Wir zeigen eine einfache Methode um Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) vorzubereiten (poly(PFPA)) gepfropft Kieselsäure Perlen für Antikörper Immobilisierung und nachfolgende Immunopräzipitation (IP) Anwendung. Die poly(PFPA) veredelte Oberfläche ist über einen einfachen Schritten bereit. Im ersten Schritt wird 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) wie ein Linker-Molekül auf der Oberfläche Kieselsäure hinterlegt. In einem zweiten Schritt poly(PFPA) Homopolymer, über die reversible Addition und Fragmentierung Kette Transfer (FLOß) Polymerisation synthetisiert ist gepfropft an die Linker-Molekül durch die Reaktion der Austausch zwischen den Pentafluorophenyl (PFP) Einheiten auf die Polymer und Amin Gruppen auf APTES. Die Abscheidung des APTES und poly(PFPA) auf die Kieselsäure Teilchen sind durch Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) bestätigt, sowie durch die Änderung der Größe der Partikel überwacht über dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessen. Verbesserung der Oberfläche Hydrophilie der Perlen, partielle Substitution von poly(PFPA) mit Poly(ethylene glycol) Amin funktionalisiert wird auch (amino-PEG) durchgeführt. Die PEG ersetzt poly(PFPA) gepfropft Kieselsäure, die Perlen mit Antikörpern für IP-Anwendung dann immobilisiert sind. Zur Demonstration ein Antikörper gegen Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) beschäftigt, und IP-Effizienz wird durch Western blotting bestimmt. Die Ergebnisse der Analyse zeigen, dass die Antikörper immobilisiert Perlen in der Tat lässt sich PKR zu bereichern, während unspezifische Protein-Interaktionen minimal sind.
Reaktive Polymer Bürsten haben viel Interesse in den letzten Jahren erhalten. Sie können verwendet werden, um funktionelle Moleküle auf organische oder anorganische Materialien für aktivierte Oberflächen mit Anwendungen in Bereichen wie Erkennung und Trennung1,2,3,4zu immobilisieren, 5. Unter die reaktive Polymere berichtet sind jene mit Pentafluorophenyl Ester Einheiten besonders aufgrund ihrer hohen Reaktivität mit Aminen und Beständigkeit gegenüber Hydrolyse6. Eine solche Polymer ist poly(PFPA) kann, und es ohne weiteres funktionalisierten nach Polymerisation mit Molekülen, die mit primären oder sekundären Aminen7,8,9,10. In einem Beispiel wurden poly(PFPA) Bürsten mit amino-Spiropyrans Licht reagierende Oberflächen7erstellen reagiert.
Die Vorbereitung der poly(PFPA) und deren Anwendungen wurden in einer Reihe von früheren Publikationen6,7,8,9,10,11,12 beschrieben ,13,14,15,16,17. Insbesondere berichtet Theato und Mitarbeiter die Synthese von poly(PFPA) Bürsten über “Pfropfen zu” und “Pfropfen aus” Methoden7,8,10,11,12 . In der “Pfropfen” Ansatz, eine Poly (Methylsilsesquioxane)-Poly (Pentafluorophenyl Acrylat) (poly(MSSQ-PFPA))-Hybrid-Polymer synthetisiert8,10,11,12war. Die poly(MSSQ)-Komponente konnte Form starke Adhäsion mit einer Reihe von verschiedenen organischen und anorganischen Oberflächen, so dass die poly(PFPA)-Komponente, die eine Bürste auf der beschichteten Oberfläche bilden. In der “Pfropfen aus” Ansatz, Oberfläche initiiert reversible Addition und Fragmentierung Kette Transfer (SI-FLOß) Polymerisation wurde eingesetzt, um poly(PFPA) Bürsten7vorzubereiten. In diesem Fall hing eine Oberfläche immobilisiert Kette Transferstelle (SI-CTA) zuerst kovalent an das Substrat durch Kieselsäure-Silan-Reaktion. Immobilisierte SI-CTA nahm dann in der SI-RAFT Polymerisation PFPA Monomere, dicht gepackten poly(PFPA) Bürsten mit stabile kovalente Anbindung an das Substrat zu erzeugen.
Durch die Nutzung der poly(PFPA) Bürsten über SI-RAFT Polymerisation synthetisiert, haben wir vor kurzem die Immobilisierung von Antikörpern auf poly(PFPA) gepfropft Silica-Partikel und deren spätere Anwendung in Protein Reinigung18gezeigt. Die Verwendung von poly(PFPA) Bürsten für Antikörper Immobilisierung erwies sich um eine Reihe von Fragen im Zusammenhang mit aktuellen Protein Trennung durch IP-zu lösen. Herkömmliche IP beruht auf der Verwendung von Protein A/G als ein Linker für Antikörper Immobilisierung19,20,21. Da die Verwendung von Protein A/G der Antikörper mit einer bestimmten Orientierung angebracht werden kann, wird eine hohe Ziel Antigen Erholung Effizienz erreicht. Allerdings leidet die Verwendung von Protein A/G unspezifische Protein-Interaktion sowie der Verlust von Antikörpern während Proteingewinnung, die ein hohes Maß an Rauschen beitragen. Um diese Mängel zu beheben, wurde die direkte Vernetzung von Antikörpern gegen eine feste Stütze erforschten22,23,24. Die Effizienz solcher Techniken ist in der Regel gering aufgrund der zufälligen Orientierung der Antikörper vernetzt. Für das Substrat poly(PFPA) gepfropft ist die Immobilisierung von Antikörpern dauerhaft, durch Austausch Reaktion zwischen PFP Einheiten und Amin Funktionalitäten auf Antikörper erreicht. Obwohl die Antikörper-Ausrichtung noch zufällig ist, profitiert das System haben viele reaktive PFP-Sites, steuerbar durch den Grad der Polymerisation. Darüber hinaus zeigten wir, dass durch partielle Substitution von PFP-Einheiten mit amino-PEG, kann Oberfläche Hydrophilie abgestimmt werden weitere Effizienzsteigerungen Protein Recovery System18. Insgesamt zeigten die poly(PFPA) gepfropft Silica-Partikel eine wirksame Alternative zu traditionellen IP mit angemessenen Effizienz sowie viel sauberer Hintergrund sein.
In diesem Beitrag berichten wir über eine alternative Methode zur poly(PFPA) veredelte Oberfläche Antikörper Immobilisierung und IP-Anwendung vorzubereiten. In zwei einfachen Schritten, wie in Abbildung 1dargestellt ein APTES Linker Molekül zuerst lagert sich auf die Silizium-Oberfläche, dann poly(PFPA) Polymer ist kovalent angeschlossen an die Linker-Molekül durch die Reaktion zwischen der PFP-Einheiten auf die Polymer und Amin-Funktionen auf APTES. Diese Vorbereitung Methode ermöglicht die permanente Vernetzung der poly(PFPA) auf einer Substratoberfläche, aber vermeidet viele Komplikationen im Zusammenhang mit SI-CTA-Synthese und SI-RAFT Polymerisation von poly(PFPA) Bürsten. Teilsubstitution der PFP-Einheiten mit amino-PEG kann noch durchgeführt werden, ermöglicht die Feinabstimmung der Oberflächeneigenschaften der Polymer-Pinsel. Wir zeigen die poly(PFPA) gepfropft Kieselsäure Perlen so vorbereitet mit Antikörper immobilisiert und zur Proteinanreicherung über IP verwendet werden können. Die detaillierte Wulst Vorbereitung Verfahren, Antikörper Immobilisierung und IP-Tests sind in diesem Artikel dokumentiert, für Leser interessierten bei der Suche nach eine Alternative zu herkömmlichen Protein A/G IP-basierte.
Die Synthese von poly(PFPA) gepfropft SiO2 Perlen in Abbildung 1dargestellt ist. Durch den Einsatz von APTES als Linker Molekül, können poly(PFPA) Bürsten kovalent gepfropft, SiO2 Substrat über einen einfachen Schritten zubereitet werden. Obwohl einige der PFP-Einheiten für die Reaktion mit APTES geopfert werden, sollen eine große Anzahl von PFP-Einheiten für spätere Reaktion mit amino-PEG oder Antikörper verfügbar bleiben. Die PFP-Gruppen sind dafür bekannt,…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Agentur für Defense Development (Grant Nr. unterstützt. UD170039ID).
2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
KCl | Invitrogen | AM9640G | |
NP-40 | VWR | E109-50ML | |
Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |