蛋白質の浄化のため Poly(pentafluorophenyl acrylate) 機能 SiO2ビーズの準備
Summary
ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) の準備のためのプロトコル (poly(PFPA)) 接木シリカビーズを提示。Poly(PFPA) 機能性表面は抗体を固定化し、正常に免疫沈降法による蛋白質の分離のために使用します。
Abstract
ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) を準備する簡単な方法を示す (poly(PFPA)) は、抗体の固定化とそれに続く免疫沈降 (IP) アプリケーションのシリカビーズを移植しました。Poly(PFPA) グラフト表面は、単純な 2 段階のプロセスを介して用意しています。最初のステップで 3-アミノプロピルトリエトキシシラン (APTES) は、シリカ表面にリンカー分子として預けられます。2 番目のステップでペンタフルオロフェニル (PFP) 単位間の交換反応によってリンカー分子に可逆的付加と断片化チェーン転送 (いかだ) 重合により合成した poly(PFPA) ホモポリマーを移植で、ポリマーと APTES のアミン グループ。APTES とシリカ粒子は x 線光電子分光法 (XPS) により確認し同様、粒子サイズの変更によって監視 poly(PFPA) の沈着は、動的光散乱 (DLS) を介して測定。ビーズ、アミン官能基化 poly(ethylene glycol) と poly(PFPA) の一部代替の表面の親水性を向上させる (アミノ PEG) が行われます。ペグ-置換 poly(PFPA) は、ビーズが IP アプリケーションのための抗体を固定化し、シリカを移植しました。デモで、タンパク質キナーゼ (PKR) rna 抗体を採用、IP 効率は西部にしみが付くことによって決定されます。分析の結果, 抗体固定化ビーズを無指定蛋白質の相互作用は最小限、PKR を豊かに使用確かにできます。
Introduction
反応性ポリマー ブラシは、近年多くの関心を受けています。検出と分離1,2,3,4などの分野でのアプリケーションと非アクティブなサーフェスを作成する有機又は無機の物質に機能分子を固定化する使用することができます。 5。報告された反応性高分子の中でペンタフルオロフェニル エステル単位を含む、アミンと加水分解6に向けて耐反応性が高いため特に便利です。1 つのようなポリマーは poly(PFPA) と、それはプライマリまたはセカンダリのアミン7,8,9,10を含む分子と容易に官能の後重合をすることができます。1 つの例で、poly(PFPA) ブラシした光応答性表面7を作成するアミノ スピロピランと反応しました。
Poly(PFPA) とその応用の準備は前出版物6,7,8,9,10、11,12 の番号に記載されています。 ,13,14,15,16,17。特に、Theato と同僚は報告「移植」と””方法7,8,10、11,12から移植の両方を介して poly(PFPA) ブラシの合成.「接木する」アプローチは、ポリ (メチルシルセスキオキサン) の-ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) (poly(MSSQ-PFPA)) ハイブリッド ・ ポリマーは合成8,10、11,12。Poly(MSSQ) コンポーネントはフォーム数材料表面上ブラシ層を形成するコンポーネントの poly(PFPA) をように別の有機・無機表面と密着できた。「接木から」アプローチ、表面は可逆的付加を開始され、断片化チェーン転送 (SI ・ ラフト) 重合を用いて poly(PFPA) ブラシ7を準備します。この場合、表面固定化連鎖移動剤 (SI CTA) 最初共有についたシリカ シラン反応による基板。固定化 SI CTA は、基板に安定した共有結合のリンケージを持つ密集 poly(PFPA) ブラシを生成する PFPA モノマーの SI ・ ラフト重合し参加しました。
SI ・ ラフト重合により合成した poly(PFPA) ブラシを活用し、最近移植 poly(PFPA) シリカ粒子やタンパク質精製18で、後続のアプリケーションにおける抗体の固定化を示した。IP で現在の蛋白質の分離に関連する問題の数を解決する抗体固定化のための poly(PFPA) ブラシの使用が見つかりました。従来の IP は、抗体固定化19,20,21のタンパク質 A/G リンカーとしての使用に依存します。タンパク質 A/G の特定の方向で接続する抗体を使用、高いターゲット抗原回復効率が達成されました。ただし、タンパク質 A/G の使用苦しんでいる抗体の損失と同様、非特異的タンパク質間相互作用タンパク質の回収、どちらもはバック グラウンド ノイズの高レベルに貢献中。これらの欠点を解決するには、しっかりサポートする抗体の直接架橋検討22,23,24をされています。このような技術の効率は架橋抗体のランダムな向きがあるため通常は低くなります。接木 poly(PFPA) 基板の抗体の固定化は永久、PFP ユニットと抗体のアミン機能間の交換反応によって達成されます。抗体の向きはまだランダムが、システム多く反応 PFP サイト、重合度によって制御を持っていることから寄与します。さらに、我々 はアミノ止め釘と PFP 単位の部分的な置換によることを示した表面親水性調整できるさらにシステム18のタンパク質回収効率を向上します。全体的にみて、多くのクリーナーの背景と同様、合理的な効率で従来の IP へ有効な代わりをする接木 poly(PFPA) シリカ粒子が示されていた。
この貢献抗体固定化と IP アプリケーションを poly(PFPA) グラフト表面を準備する方法を報告する.単純な 2 段階のプロセスで図 1に示すように、APTES のリンカー分子最初に到着したシリカ表面にし、poly(PFPA) 高分子に PFP ユニット間反応によってリンカー分子に接続した、ポリマーと APTES のアミン機能。本調製法は基板表面に poly(PFPA) の永久的な架橋が可能が SI CTA 合成と poly(PFPA) ブラシの SI ・ ラフト重合に関連する多くの合併症を回避します。アミノ ペグの PFP ユニットの部分置換実行できますが、ポリマー ブラシ表面特性の微調整可能します。従って準備 poly(PFPA) 接木シリカビーズを抗体を固定化して IP を介したタンパク質の濃縮に使用できますを示します。詳細なビード作製手順、抗体固定化と IP テストは、この資料に記載されて、読者を求めて興味従来タンパク質 A/G に代わるベースの IP。
Protocol
Representative Results
Discussion
Poly(PFPA) の合成は接ぎ木 SiO2ビーズは図 1に示します。リンカー分子として APTES を採用し、単純な 2 段階のプロセスを介して SiO2基板に移植した poly(PFPA) ブラシを用意できます。PFP の単位のいくつかが APTES との反応を犠牲に、多数の PFP ユニットがアミノ ペグまたは抗体のいずれかで後の反応に利用可能なままと予想します。PFP グループは、poly(PFPA) ブ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、防衛開発 (グラント号の代理店によって支えられました。UD170039ID)。
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Referências
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
