पाली की तैयारी (pentafluorophenyl acrylate) कार्यात्मक सिइओ2 मोती प्रोटीन शुद्धि के लिए
Summary
पाली (pentafluorophenyl acrylate) की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल (पाली (PFPA)) भ्रष्टाचारी सिलिका मोती प्रस्तुत किया है । पाली (PFPA) कार्यात्मक सतह तो एंटीबॉडी के साथ मैटीरियल है और immunoprecipitation के माध्यम से प्रोटीन जुदाई के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया ।
Abstract
हम पाली (pentafluorophenyl acrylate) (पाली (PFPA)) एंटीबॉडी स्थिरीकरण और बाद में immunoprecipitation (आईपी) आवेदन के लिए भ्रष्टाचारी सिलिका मोतियों तैयार करने के लिए एक सरल विधि का प्रदर्शन । पाली (PFPA) भ्रष्टाचार सतह एक सरल दो कदम प्रक्रिया के माध्यम से तैयार किया जाता है । पहले चरण में, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) सिलिका की सतह पर एक linker अणु के रूप में जमा किया जाता है । दूसरे चरण में, पाली (PFPA) homopolymer, प्रतिवर्ती अतिरिक्त और विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (बेड़ा) बहुलकीकरण के माध्यम से संश्लेषित, पर pentafluorophenyl (PFP) इकाइयों के बीच विनिमय प्रतिक्रिया के माध्यम से लिंकर अणु को भ्रष्टाचारी है बहुलक और APTES पर अमीन समूहों । सिलिका कणों पर APTES और पाली (PFPA) का जमाव एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) द्वारा पुष्टि कर रहे हैं, साथ ही साथ गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS) के माध्यम से मापा कण आकार परिवर्तन द्वारा निगरानी की । मोतियों की सतह hydrophilicity में सुधार करने के लिए, अमीन-कार्यात्मक पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल) (अमीनो-खूंटी) के साथ पाली (PFPA) के आंशिक प्रतिस्थापन भी किया जाता है । खूंटी के स्थानापन्ना पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका मनका तो आईपी आवेदन के लिए एंटीबॉडी के साथ मैटीरियल हैं. प्रदर्शन के लिए, एक एंटीबॉडी के खिलाफ प्रोटीन कळेनासे आरएनए-सक्रिय (PKR) कार्यरत है, और आईपी दक्षता पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया जाता है । विश्लेषण परिणाम बताते है कि एंटीबॉडी मैटीरियल मोती वास्तव में PKR को समृद्ध किया जा सकता है, जबकि गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत कम कर रहे हैं ।
Introduction
प्रतिक्रियाशील बहुलक ब्रश हाल के वर्षों में बहुत रुचि प्राप्त की है । वे जैविक या अकार्बनिक पदार्थों पर कार्यात्मक अणुओं को स्थिर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे पता लगाने और जुदाई1,2,3,4के रूप में क्षेत्रों में आवेदनों के साथ सतहों सक्रिय, 5. प्रतिक्रियाशील पॉलिमर के अलावा, उन pentafluorophenyl एस्टर इकाइयों युक्त विशेष रूप से hydrolysis6की ओर अमीन और प्रतिरोध के साथ अपने उच्च जेट के कारण उपयोगी होते हैं । ऐसा ही एक बहुलक पाली (PFPA) है, और यह आसानी से कार्यात्मक हो सकता है के बाद प्राथमिक या माध्यमिक अमीन से युक्त अणुओं के साथ बहुलकीकरण7,8,9,10। एक उदाहरण में, पाली (PFPA) ब्रश एमिनो-spiropyrans के साथ प्रकाश उत्तरदायी सतहों7बनाने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की गई ।
पाली (PFPA) की तैयारी और इसके आवेदनों में पिछले प्रकाशनों की संख्या6,7,8,9,10,11,12 बताई गई है ,13,14,15,16,17। विशेष रूप से, Theato और सह कार्यकर्ताओं पाली के संश्लेषण की सूचना (PFPA) दोनों “के लिए भ्रष्टाचार” और “से” तरीकों7,8,10,11,12 के माध्यम से कलम बांधने की ब्रश . “” के दृष्टिकोण को भ्रष्टाचार में, एक पाली (methylsilsesquioxane)-पाली (pentafluorophenyl acrylate) (पाली (MSSQ-PFPA)) संकर बहुलक8,10,11,12संश्लेषित किया गया था । पाली (MSSQ) घटक विभिन्न कार्बनिक और अकार्बनिक सतहों के एक नंबर के साथ मजबूत आसंजन के रूप में सक्षम था, इस प्रकार पाली (PFPA) घटक लेपित सामग्री सतह पर एक ब्रश परत बनाने के लिए अनुमति । “से” दृष्टिकोण में भ्रष्टाचार, सतह प्रतिवर्ती इसके अलावा शुरू की और विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (SI-बेड़ा) बहुलकीकरण पाली (PFPA)7ब्रश तैयार करने के लिए कार्यरत था । इस मामले में, एक सतह मैटीरियल चेन स्थानांतरण एजेंट (SI-CTA) पहले सिलिका-silane प्रतिक्रिया के माध्यम से सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न covalently था । इसके बाद मैटीरियल एसआई-CTA ने PFPA मोनोमर के एसआई-बेड़ा बहुलकीकरण में भाग लिया, जो सब्सट्रेट को स्थिर PFPA लिंकेज के साथ घनी खचाखच पाली (आबंध) ब्रश पैदा करते हैं ।
पाली (PFPA) SI-बेड़ा बहुलकीकरण के माध्यम से संश्लेषित ब्रश का उपयोग करके, हम हाल ही में पाली पर एंटीबॉडी के स्थिरीकरण का प्रदर्शन (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका कणों और उनके प्रोटीन शुद्धिकरण में बाद में आवेदन18. पाली (PFPA) एंटीबॉडी के लिए ब्रश का उपयोग आईपी के माध्यम से वर्तमान प्रोटीन जुदाई से जुड़े मुद्दों की एक संख्या को हल करने के लिए पाया गया था । पारंपरिक आईपी एंटीबॉडी स्थिरीकरण के लिए एक लिंकर के रूप में प्रोटीन ए/जी के उपयोग पर निर्भर करता है19,20,21। प्रोटीन के उपयोग के बाद से एक/जी एंटीबॉडी एक विशिष्ट अभिविंयास के साथ संलग्न करने के लिए अनुमति देता है, उच्च लक्ष्य प्रतिजन वसूली दक्षता हासिल की है । हालांकि, प्रोटीन का उपयोग एक/जी गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत से ग्रस्त है और साथ ही प्रोटीन वसूली के दौरान एंटीबॉडी के नुकसान, दोनों जिनमें से पृष्ठभूमि शोर के एक उच्च स्तर पर योगदान करते हैं । इन कमियों को हल करने के लिए एक ठोस समर्थन के लिए एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष crosslinking22,23,24का पता लगाया गया है । इस तरह की तकनीक की दक्षता आमतौर पर crosslinked एंटीबॉडी के यादृच्छिक अभिविन्यास के कारण कम है. पाली (PFPA) के लिए भ्रष्टाचार सब्सट्रेट, एंटीबॉडी के स्थिरीकरण, PFP इकाइयों और एंटीबॉडी पर अमीन कार्यक्षमताओं के बीच विनिमय प्रतिक्रिया के माध्यम से प्राप्त की स्थायी है । हालांकि एंटीबॉडी उंमुखीकरण अभी भी यादृच्छिक है, कई प्रतिक्रियाशील PFP साइटों होने से प्रणाली लाभ, बहुलकीकरण की डिग्री के द्वारा नियंत्रित । इसके अलावा, हमने दिखाया है कि अमीनो के साथ PFP इकाइयों के आंशिक प्रतिस्थापन से खूंटी, सतह hydrophilicity, देखते जा सकता है और18प्रणाली के प्रोटीन रिकवरी दक्षता में सुधार । कुल मिलाकर, पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका कणों उचित दक्षता के साथ ही बहुत क्लीनर पृष्ठभूमि के साथ पारंपरिक आईपी के लिए एक प्रभावी विकल्प होने के लिए दिखाए गए थे.
इस योगदान में, हम एंटीबॉडी स्थिरीकरण और आईपी आवेदन के लिए पाली (PFPA) भ्रष्टाचार सतह तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति की रिपोर्ट । एक सरल दो कदम प्रक्रिया में, के रूप में चित्रा 1में सचित्र, एक APTES linker अणु पहले सिलिका सतह पर जमा है, तो पाली (PFPA) बहुलक पर PFP इकाइयों के बीच प्रतिक्रिया के माध्यम से लिंकर अणु से जुड़ी covalently है बहुलक और APTES पर अमीन कार्य करता है । इस तैयारी विधि एक सब्सट्रेट सतह करने के लिए पाली (PFPA) के स्थायी crosslinking के लिए अनुमति देता है, लेकिन एसआई-CTA संश्लेषण और पाली (PFPA) ब्रश के एसआई-बेड़ा बहुलकीकरण के साथ जुड़े कई जटिलताओं से बचा जाता है । अमीनो-खूंटी के साथ PFP इकाइयों के आंशिक प्रतिस्थापन अभी भी प्रदर्शन किया जा सकता है, की अनुमति ठीक बहुलक ब्रश सतह संपत्तियों की ट्यूनिंग । हम पाली (PFPA) भ्रष्टाचारी सिलिका मोती इस प्रकार तैयार एंटीबॉडी के साथ स्थिर किया जा सकता है और आईपी के माध्यम से प्रोटीन संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया दिखा । विस्तृत मनका तैयारी प्रक्रिया, एंटीबॉडी स्थिरीकरण, और आईपी परीक्षण इस लेख में प्रलेखित हैं, पारंपरिक प्रोटीन के लिए एक विकल्प की मांग में रुचि पाठकों के लिए एक/
Protocol
Representative Results
Discussion
पाली (PFPA) के संश्लेषण सिइओ2 मोतियों की माला 1 चित्रामें सचित्र है । एक linker अणु के रूप में APTES को रोजगार से, पाली (PFPA) ब्रश covalently सिइओ2 सब्सट्रेट करने के लिए भ्रष्टाचारी एक सरल दो कदम प्रक्रिया क…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एजेंसी फॉर डिफेंस डेवलपमेंट (ग्रांट नो. UD170039ID) ।
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Referências
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
