Beredning av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 pärlor för Protein rening
Summary
Ett protokoll för beredning av poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(PFPA)) ympade kiseldioxid pärlor presenteras. Poly(PFPA) functionalized ytan sedan orörlig med antikroppar och används framgångsrikt för protein separation genom immunoprecipitation.
Abstract
Vi visar en enkel metod för att förbereda poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(PFPA)) ympade kiseldioxid pärlor för antikropp immobilisering och efterföljande immunoprecipitation (IP) ansökan. Poly(PFPA) ympade ytan är beredd via en enkel tvåstegsprocess. I det första steget sätts 3-aminopropyltrietoxisilan (APTES) som en länkare molekyl på kisel ytan. I det andra steget, poly(PFPA) homopolymer, syntetiseras via reversibel tillägg och fragmentering kedja överföring (flotte) polymerisation, ympas till länkaren molekylen genom exchange reaktion mellan pentafluorophenyl (PFP) enheter på den polymer och amine grupperna på APTES. Nedfallet av APTES och poly(PFPA) på kiseldioxid partiklar är bekräftat av röntgen fotoelektronen spektroskopi (XPS), såväl som övervakas av partikel storlek förändringen mätt via dynamiska ljusspridning (DLS). För att förbättra den ytan hydrophilicitet av pärlor, delvis ersättning av poly(PFPA) med amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) utförs också. Den PEG-substituerade poly(PFPA) ympade kiseldioxid pärlor immobilizeds sedan med antikroppar för IP-programmet. För demonstration, en antikropp mot proteinkinas RNA-aktiverat (PKR) är anställd, och IP-effektivitet bestäms av Western blotting. Analysresultaten visar att antikropp orörlig pärlorna faktiskt kan användas för att berika PKR medan icke-specifika proteininteraktioner är minimal.
Introduction
Reaktiva polymer borstar har fått stort intresse under de senaste åren. De kan användas för att immobilisera funktionella molekyler på organiska eller oorganiska material att skapa aktiverade ytor med tillämpningar inom områden som upptäckt och separation1,2,3,4, 5. Bland den reaktiva polymerer rapporterade, är de som innehåller pentafluorophenyl ester enheter särskilt användbart på grund av deras höga reaktivitet med aminer och beständighet mot hydrolys6. En sådan polymer är poly(PFPA), och det kan vara lätt functionalized efter polymerisation med molekyler som innehåller primära eller sekundära aminer7,8,9,10. I ett exempel, var poly(PFPA) borstar reagerade med amino-spiropyrans att skapa ljus-lyhörd ytor7.
Utarbetandet av poly(PFPA) och dess tillämpningar har beskrivits i ett antal tidigare publikationer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. I synnerhet rapporterade Theato och medarbetare syntesen av poly(PFPA) borstar via både ”ympning till” och ”ympning från” metoder7,8,10,11,12 . I den ”ympning till” tillvägagångssätt, en poly (methylsilsesquioxane)-poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(MSSQ-PFPA)) hybrid polymer var syntetiseras8,10,11,12. Komponenten poly(MSSQ) kunde form stark vidhäftning med ett antal olika organiska och oorganiska ytor, vilket gör att komponenten poly(PFPA) att bilda en borste lager på belagda materialets yta. I den ”ympning från” tillvägagångssätt, ytan initierade reversibel tillägg och fragmentering kedja överföring (SI-flotte) polymerisation anställdes att förbereda poly(PFPA) borstar7. I det här fallet fästes en surface immobiliserade kedja överföring agent (SI-CTA) först kovalent till substratet via kiseldioxid-silane reaktion. Den immobiliserade SI-CTA deltog sedan i SI-flotte polymerisation av PFPA monomerer, generera tätt packade poly(PFPA) borstar med stabil kovalent koppling till substratet.
Genom att utnyttja poly(PFPA) borstarna syntetiseras via SI-flotte polymerisation, visat vi nyligen immobilisering av antikroppar på poly(PFPA) ympade kiseldioxid partiklar och deras efterföljande ansökan i protein rening18. Användning av poly(PFPA) borstar för antikropp immobilisering konstaterades för att lösa ett antal frågor i samband med nuvarande protein avskiljande via IP. Konventionella IP är beroende av användningen av Protein A/G som en länkare för antikropp immobilisering19,20,21. Eftersom användningen av Protein från A/G tillåter antikropparna bifogas med en specifik orientering, uppnås höga mål antigen återhämtning effektivitet. Men lider användningen av Protein från A/G av icke-specifika protein interaktion samt förlust av antikroppar under protein återhämtning, vilka båda bidrar till en hög nivå av bakgrundsbrus. Lös dessa brister genom varit direkta crosslinking av antikroppar till ett fast stöd utforskade22,23,24. Effektiviteten av sådana tekniker är vanligtvis låg på grund av slumpmässig orientering av tvärbunden antikroppar. För poly(PFPA) ympade substratet är immobilisering av antikroppar permanent, uppnås genom exchange reaktion mellan PFP enheter och amine funktioner på antikroppar. Även om antikroppar orientering är fortfarande slumpmässigt förmåner systemet från att ha många reaktiva PFP platser, kontrollerbar av graden av polymerisation. Dessutom visade vi som av delvis ersättning av PFP enheter med amino-PEG, surface hydrophilicitet kan stämmas, ytterligare förbättra protein återvinning effektiviteten av systemet18. Sammantaget har poly(PFPA) ympade kiseldioxid partiklar visat sig vara ett effektivt alternativ till traditionella IP med rimlig effektivitet samt mycket renare bakgrund.
I detta bidrag redovisar vi en alternativ metod att förbereda poly(PFPA) ympade yta för antikropp immobilisering och IP-program. I en enkel tvåstegsprocess, som illustreras i figur 1, är en APTES linker molekyl först deponeras på kisel ytan, sedan poly(PFPA) polymeren bifogas kovalent linker molekylen genom reaktion mellan PFP enheter på den polymer och amine funktioner på APTES. Denna förberedelse metod möjliggör den permanenta crosslinking av poly(PFPA) till en yta med substrat, men undviker många komplikationer i samband med SI-CTA syntes och SI-flotte polymerisation av poly(PFPA) penslar. Delvis ersättning av PFP aggregat med amino-PEG kan fortfarande utföras, möjliggör finjustering av polymer borste ytegenskaper. Vi visar poly(PFPA) ympade kiseldioxid pärlorna således beredd kan vara orörlig med antikroppar och används för protein berikning via IP. Den detaljerade pärla arbetsgången, antikropp immobilisering och IP-testning är dokumenterade i denna artikel, för läsare intresserade söker ett alternativ till konventionella Protein A/G baserat IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syntesen av poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor illustreras i figur 1. Genom att använda APTES som en länkare molekyl, kan poly(PFPA) borstar kovalent ympade SiO2 substratet förberedas via en enkel tvåstegsprocess. Även om vissa av enheterna som PFP offras för reaktionen med APTES, förväntas ett stort antal PFP enheterna förbli tillgängliga för senare reaktion med antingen amino-PEG eller antikroppar. PFP grupper är kända för att bilda låg energi ytor så poly…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av byrån för Defense utveckling (Grant nr. UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Referências
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
