Lucifer Yellow - Un marqueur de perméabilité paracellulaire robuste dans un modèle cellulaire de la barrière de sang-cerveau humain

Summary

Nous présentons un test de fluorescence pour démontrer que Lucifer Yellow (LY) est un marqueur robuste pour déterminer la perméabilité paracellulaire apparente des monocouches de cellules hCMEC/D3, un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique humaine. Nous avons utilisé cet exemple pour déterminer la cinétique d’une formation de monocouches confluentes dans les cellules cultivées de hCMEC/D3.

Abstract

La barrière hémato-encéphalique BBB se compose de cellules endothéliales qui forment une barrière entre la circulation systémique et le cerveau pour empêcher l’échange d’ions non essentiels et de substances toxiques. Les jonctions serrées (TJ) scellent efficacement l’espace paracellulaire dans les monocouches, ce qui donne lieu à une barrière intacte. Cette étude décrit un analyse de fluorescence basée sur LY qui peut êtreutilisé pour déterminer son coefficient de perméabilité apparente (application P ) et à son tour peut être utilisé pour déterminer la cinétique de la formation de monocouches confluents et la jonction serrée résultante l’intégrité de la barrière dans les monocouches hCMEC/D3. Nous démontrons en outre une utilité additionnelle de cet analyse pour déterminer l’intégrité fonctionnelle de TJ dans les cellules transfected. Nos données de l’analyse de l’application LY P montrent que les cellules hCMEC/D3 ensemant dans une configuration de transwell limitent efficacement le transport paracellulaire LY 7 jours-post culture. En tant qu’utilité supplémentaire de l’analyse présentée, nous démontrons également que la transfection de nanoparticules d’ADN ne modifie pas le transport paracellulaire de LY dans les monocouches de hCMEC/D3.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est la barrière protectrice limitant l’afflux de composants plasmatiques dans le tissu cérébral et se compose de cellules endothéliales du cerveau ainsi que de cellules de soutien telles que les péritéytes. Le rôle principal de BBB est de servir de barrière qui scelle l’espace entre le sang périphérique et le système nerveux central (SNC) pour maintenir l’hémostase du microenvironnement neuronal^1,2. Les cellules endothéliales capillaires du cerveau scellent efficacement la voie paracellulaire par la formation de jonctions intercellulaires serrées (TJs)¹. Cette barrière protectrice permet au glucose et aux nutriments sélectionnés d’entrer dans le cerveau alors qu’elle empêche la majorité des ions, des substances toxiques et des médicaments de passer à travers cette barrière serrée. Outre son rôle protecteur, la fonction de barrière naturelle du BBB pose un défi grave dans le développement de systèmes d’administration de médicaments ciblant le SNC.

Les modèles de culture cellulaire in vitro du BBB sont des outils utiles pour étudier sa biologie et comprendre les effets du traitement médicamenteux sur l’intégrité de la barrière tJ. Nous avons utilisé la lignée cellulaire endothéliale microvasculaire humaine (hCMEC/D3) comme modèle in vitro puisqu’il s’agit d’un modèle accepté d’endothélium du cerveau humain³ et récapitule de nombreuses fonctions du BBB humain. hCMEC/D3is l’une des lignées cellulaires les plus couramment utilisées pour modéliser le BBB in vitro^4,5,6,7,8,9. Malgré ses valeurs relativement faibles de résistance électrique transendothéliale (TEER), une mesure de l’étanchéité de barrière, cette ligne cellulaire conserve la plupart des propriétés morphologiques et fonctionnelles des cellules endothéliales de cerveau, même comme monoculture en l’absence de cellules gliales cocultivées^6,7. La lignée cellulaire hCMEC/D3 exprime plusieurs marqueurs BBB, y compris les transporteurs actifs et les récepteurs jusqu’à environ passage 35 sans subir de dédifférenciation aux phénotypes instables^{6,7,9 ,10,11}. La caractéristique la plus frappante de la lignée cellulaire hCMEC/D3 en tant que modèle BBB in vitro est sa capacité à former des TJs^5,9,11,12. Il convient de noter que bien que les modèles BBB dérivés de cellules souches aient montré une perméabilité plus élevée dans de nombreuses études par rapport à la lignée cellulaire hCMEC/D3 et qu’ils expriment certains marqueurs BBB, ils n’ont pas encore évolué en tant que modèle de cellules BBB le plus commun¹³. Fait important, les modèles BBB dérivés de cellules souches restent à caractériser en ce qui concerne les nombres de passage maximaux qui permettent aux cellules de maintenir des phénotypes BBB stables¹⁴.

Trois méthodes primaires sont couramment utilisées pour déterminer l’intégrité de la barrière TJ, ycompris la mesure de TEER, la mesure du coefficient de perméabilité apparente (application P ) de petites molécules de traceur hydrophile telles que le saccharose, l’inuline, Lucifer Yellow, etc. et l’immunostaining des marqueurs moléculaires connus des TJs tels que claudin-5, ZO-1, occludin, etc.^5. TEER est une méthode relativement simple et quantitative qui mesure la résistance électrique à travers les monocouches cellulaires cultivées sur un substrat de membrane poreux⁵. Cependant, les valeurs TEER peuvent être influencées par des variables expérimentales telles que la composition du milieu de culture et le type d’instrument de mesure. Une combinaison probable de ces facteurs conduit à une large distribution des valeurs TEER allant de 2 à 1150 cm² dans la lignée cellulaire hCMEC/D3 cultivée pendant 2-21 jours¹³. Immunostaining est une méthode visuelle pour déterminer la présence de protéines TJ en étiquetant la protéine ciblée à l’aide d’anticorps. Cependant, l’immunostaining implique une série d’étapes expérimentales, y compris la nécessité de fixer/perméabilize des cellules qui peuvent avoir comme conséquence des artefacts expérimentaux et les signaux fluorescents peuvent s’estomper avec le temps. Les facteurs ci-dessus peuvent entraîner des erreurs subjectives affectant la qualité des données.

L’objectif principal de ce travail est de présenter un assay apparent de perméabilité basé sur LY déterminer la cinétique d’une formation de monocouche confluente dans les cellules cultivées de hCMEC/D3. Bien que d’autres systèmes BBB in vitro avancés, tels que les systèmes de co-culture, les systèmes microfluidiques, sont physiologiquement plus pertinents imite avec la fonction de barrière sensiblement améliorée^15,16,17, le hCMEC/D3 la configuration de transwell est un modèle simple et fiable pour estimer les cinétiques de la formation de TJ et examiner rapidement l’effet de différentes formulations de drogue sur la fonction de barrière. En général, les valeurs de l’application P sont cohérentes pour divers solutés hydrophiles dans les monocouches hCMEC/D3. Par exemple, les valeurs de l’application P signalées pour divers solutés de masse moléculaire faible (comme le saccharose, le mannitol, le LY, etc.) dans différents modèles BBB in vitro sont de l’ordre de 10^-4 cm/min^{5,18,19 , 20}. Dans notre configuration expérimentale, les cellules endothéliales de cerveau sont ensemies sur une membrane micropore collagène-enduite pour l’attachement cellulaire et la formation de monocouche pour imiter la barrière in vivo. Le LY ajouté dans le côté apical devrait traverser les jonctions intercellulaires serrées et s’accumuler dans le côté basolatéral. De plus grandes concentrations de LY dans le côté basolatéral indiquent une barrière immature et non entièrement fonctionnelle tandis que des concentrations plus faibles reflètent le transport restreint dû à la présence de TJs fonctionnels ayant pour résultat une barrière mûre.

LY est un colorant hydrophile avec des pics d’excitation/émission distincts et évite la nécessité de radiolabel molécules traceurs telles que le saccharose, le mannitol ou l’inuline. Ainsi, les valeurs de fluorescence de LY peuvent être utilisées pour calculer directement sa perméabilité paracellulaire à travers les monocouches BBB. En outre, par rapport à de nombreux colorants disponibles dans le commerce utilisés dans les domaines biomédicaux qui souffrent de petits changements Stokes tels que la fluorescéine²¹, le changement Stokes de LY est d’environ 108 nm avec une séparation spectrale suffisante, permettant ainsi des données de fluorescence LY comme un lecture robuste pour déterminer la perméabilité paracellulaire. Nous avons utilisé le ballonnement occidental comme technique orthogonale pour démontrer des changements dans l’expression de la protéine de marqueur de jonction serrée, ZO-1, au cours du temps de culture. L’expression ZO-1 détectée par le biais de l’adhérence occidentale est utilisée pour compléter les données de l’application LY P et, en combinaison, ces données suggèrent que les changements observés dans les valeurs de l’application LY P reflètent la formation d’un monocouche avec une augmentation graduelle l’expression du marqueur de jonction serré, ZO-1.

Comme nous l’avons souligné précédemment, l’objectif central de ce travail est de démontrer un test LY comme une technique simple pour surveiller la formation d’une monocouche confluente avec des jonctions fonctionnelles serrées. Cependant, pour démontrer une utilité supplémentaire de l’analyse développée, nous avons mesuré l’application LY P dans des monocouches hCMEC/D3 transfées d’ADN. Les acides nucléiques peuvent être condensés en nanoparticules de polyélectrolyte d’un diamètre de 100-200 nm par l’intermédiaire d’une interaction électrostatique entre les groupes de polymères chargés positivement et les groupes de phosphate chargés négativement d’acides nucléiques^{22, 23}. Nous nous référons à ces complexes sous le compte des nanoparticules d’ADN (NP d’ADN) dans nos travaux. Bien que notre intention soit de transfect cellules et d’exprimer la protéine désirée, nous devons nous assurer que les propriétés de barrière des monocouches hCMEC/D3 ne sont pas compromises. Nos données suggèrent qu’un régime standard de transfection de gène de luciferase de 4 h ne change pas mesurablement la perméabilité de LY démontrant l’utilité de l’analyse d’application de LY P pour déterminer des changements dans l’intégrité de barrière de TJ.

Protocol

1.Général hCMEC/D3 culture cellulaire Réanimation de cellules congeléesREMARQUE : Tous les entretiens et expériences de culture cellulaire ont été exécutés à l’intérieur d’une hotte stérile de biosécurité. Les supports culturels, les suppléments et les réactifs ont été achetés comme produits stériles ou stérilisés par filtration à l’aide d’un filtre à membrane de 0,22 m pour prévenir la contamination microbienne. Ajouter 8,5 ml de solution de collagène (0,1…

Representative Results

Tout d’abord, nous avons déterminé l’effet du temps de culture sur la perméabilité de LY pour déterminer les cinétique apparentes de la formation de TJ. Les valeurs moyennes de l’application LY P du jour 1 à 10 après l’ensemencement sont indiquées dans la figure 2a. Le jour 1, l’application P moyenne était de 4,25 x 10-4 cm/min et a légèrement chuté à 3,32 x 10-4 cm/min le jour 2. La valeur …

Discussion

Un rôle clé du BBB est d’empêcher l’échange d’ions non essentiels et de substances toxiques entre la circulation systémique et le cerveau pour maintenir l’hémostase du microenvironnement neural. Une des caractéristiques du BBB est la capacité des cellules endothéliales capillaires à former des jonctions serrées (TJs) qui scellent efficacement la voie paracellulaire du transport. Nous avons démontré un essai d’application de LY P comme méthode quantitative pour déterminer la cinétique apparente …

Materials

hCMEC/D3 cell line	Cedarlane Laboratories	102114.3C-P25	human cerebral microvascular endothelial cell line
gWizLuc	Aldevron	5000-5001	Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt	Invitrogen	155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes	Falcon	353095
Tissue culture flask	Olympus Plastics	25-207
24-well Flat Bottom	Olympus Plastics	25-107
Black 96-Well Immuno Plates	Thermo Scientific	437111
S-MEM 1X	Gibco	1951695	Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2	Clonetics	CC-3156	Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)
phosphate-buffered saline 1X	HyClone	SH3025601
Collagen Type I	Discovery Labware, Inc.	354236
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent	Promega	E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt	Promega	E1601
SpectraMax i3	Molecular Devices		Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody	ThermoFisher	61-7300
anti-GAPDH antibody	abcam	ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)	Jackson ImmunoResearch Inc	128817
12-well, Flat Bottom	Olympus Plastics	25-106
RIPA buffer (5X)	Alfa Aesar	J62524
Aprotinin	Fisher BioReagents	BP2503-10
Odyssey CLx imager	LI-COR Biosciences		for scanning western blot membranes