Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

Summary

Nós apresentamos um ensaio da fluorescência para demonstrar que o amarelo de Lucifer (ly) é um marcador robusto para determinar a permeabilidade transcelulares paracelulares aparente de monolayers da pilha de hcmec/D3, um in vitro modelo da barreira Human do sangue-cérebro. Utilizou-se este ensaio para determinar a cinética de formação de monocamada confluente em células hCMEC/D3 cultivadas.

Abstract

A barreira sangue-cérebro BBB consiste em células endoteliais que formam uma barreira entre a circulação sistêmica e o cérebro para evitar a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas. Junções apertadas (TJ) efetivamente selar o espaço paracelular nas monocamadas resultando em uma barreira intacta. Este estudo descreve um ensaio de fluorescência com base em ly que pode ser usado para determinar o seu coeficiente de permeabilidade aparente (P_app) e, por sua vez, pode ser usado para determinar a cinética da formação de monocamadas confluentes e a junção apertada resultante integridade de barreira em monocamada de hCMEC/D3. Nós demonstramos mais uma utilidade adicional deste ensaio para determinar a integridade funcional de TJ em pilhas transfected. Nossos dados do ensaio do_aplicativo ly P mostram que as células hCMEC/D3 semeadas em uma configuração de transpoços efetivamente limitam o transporte de ly paracelular 7 dias-pós cultura. Como uma utilidade adicional do ensaio apresentado, nós igualmente demonstramos que o transfection da nanopartícula do ADN não altera o transporte de ly transcelulares paracelulares em monolayers de hcmec/D3.

Introduction

A barreira hematoencefálica (BBB) é a barreira protetora que limita o afluxo de componentes plasmáticos no tecido cerebral e consiste em células endoteliais cerebrais, juntamente com células de apoio, como pericytes. O papel principal do BBB é servir como uma barreira que sela o espaço entre o sangue periférico e o sistema nervoso central (CNS) para manter a hemostasia do microambiente neural^1,2. As pilhas endothelial capilares do cérebro selam eficazmente a via transcelulares paracelulares através da formação de junções apertadas intercelular (TJs)¹. Esta barreira protetora permite glicose e nutrientes selecionados para entrar no cérebro, enquanto impede a maioria dos íons, substâncias tóxicas e drogas de passar por esta barreira apertada. Aparte de seu papel protetor, a função natural da barreira do BBB levanta um desafio severo no desenvolvimento de sistemas da entrega da droga que visam o CNS.

In vitro modelos de cultura celular do BBB são ferramentas úteis para estudar a sua biologia e para compreender os efeitos do tratamento medicamentoso sobre a integridade da barreira TJ. Nós usamos a linha de pilha endothelial microvascular cerebral humana (hcmec/D3) como um in vitro modelo desde que é um modelo aceitado do endotélio do cérebro humano³ e recapitula muitas funções do BBB humano. hcmec/D3is uma das linhas celulares mais comumente utilizadas para modelar o BBB in vitro^4,5,6,7,8,9. Apesar de seus valores comparativamente baixos de resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de aperto de barreira, esta linha celular retém a maioria das propriedades morfológicas e funcionais das células endoteliais cerebrais, mesmo como uma monocultura na ausência de células gliais cocultivadas^6,7. A linha celular hcmec/D3 expressa vários marcadores BBB^,incluindo transportadores e receptores ativos até aproximadamente a passagem 35 sem sofrer desdiferenciação com fenótipos instáveis^{6,7,9 ,10,11}. A característica mais marcante da linha celular hcmec/D3 como modelo in vitro BBB é sua capacidade de formar TJs^5,9,11,12. Deve-se notar que, embora os modelos de BBB derivado de células-tronco mostraram maior permeabilidade em muitos estudos em comparação com a linha celular hCMEC/D3 e expressam alguns marcadores BBB, eles ainda estão a evoluir como o modelo de célula BBB mais comum¹³. É importante ressaltar que os modelos BBB derivados de células-tronco permanecem caracterizados em relação aos números máximos de passagem que permitem que as células mantenham fenótipos BBB estáveis¹⁴.

Três métodos primários são comumente usados para determinar a integridade da barreira TJ, incluindo a medida de TEER, medição do coeficiente de permeabilidade aparente (P_app) de pequenas moléculas de traçador hidrófilo como sacarose, inulina, Lúcifer Yellow, etc. e imunocoloração de marcadores moleculares conhecidos de TJs tais como Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.⁵. TEER é um método relativamente simples e quantitativo que mede a resistência elétrica através das monocamadas celulares cultivadas em substrato de membrana porosa⁵. No entanto, os valores de TEER podem ser influenciados por variáveis experimentais como a composição do meio de cultura e o tipo de instrumento de medida. Uma provável combinação desses fatores leva a uma ampla distribuição de valores de TEER variando de 2 a 1150 Ω cm² na linha celular hCMEC/D3 cultivada por 2-21 dias¹³. A imunocoloração é um método Visual para determinar a presença de proteínas TJ através da rotulagem da proteína alvo usando anticorpos. No entanto, a imunocoloração envolve uma série de etapas experimentais, incluindo a necessidade de fixar/permeabilizar as células que podem resultar em artefatos experimentais e os sinais fluorescentes podem desaparecer ao longo do tempo. Os fatores acima podem levar a erros subjetivos que afetam a qualidade dos dados.

O foco preliminar deste trabalho é apresentar um ensaio aparente da permeabilidade de ly-based determina a cinética de uma formação confluente do monocamada em pilhas hcmec/D3 cultivadas. Embora outros sistemas avançados de BBB in vitro, tais como sistemas de cocultura, sistemas microfluílicos, sejam imita fisiologicamente mais relevantes com função de barreira significativamente melhorada^15,16,17, o hcmec/D3 a instalação do transwell é um modelo simples e de confiança para estimar a cinética da formação de TJ e para ràpida a tela o efeito de formulações diferentes da droga na função da barreira. Em geral, os valores de P_app são consistentes para vários solutos hidrófilos em monolayers hCMEC/D3. Por exemplo, os valores do_aplicativo P relatados para vários solutos de massa molecular baixa (como sacarose, manitol, ly, etc.) em diferentes modelos de BBB in vitro estão na ordem de 10^-4 cm/min^{5,18,19 , 20}. em nossa instalação experimental, as pilhas endothelial do cérebro são semeadas em uma membrana microporosa colagénio-revestida para o acessório da pilha e a formação do monocamada para imitar a barreira in vivo. O ly adicionado no lado apical é esperado atravessar as junções apertadas intercelular e acumular-se no lado basolateral. As concentrações maiores de LY no lado basolateral indicam uma barreira imatura, não-inteiramente funcional quando umas mais baixas concentrações refletirem o transporte restrito devido à presença de TJs funcionais tendo por resultado uma barreira madura.

LY é um corante hidrófilo com picos de excitação/emissão distintos e evita a necessidade de moléculas de traçador radiomarcar como sacarose, manitol ou inulina. Assim, os valores de fluorescência de LY podem ser usados para calcular diretamente sua permeabilidade paracelular através das monocamada BBB. Também, comparado a muitos corantes comercialmente disponíveis usados em campos biomédicos que sofrem de pequenas mudanças Stokes, como fluoresceina²¹, a mudança Stokes de ly é de cerca de 108 nm com separação espectral suficiente, permitindo assim que os dados de fluorescência ly como um leitura robusta para determinar a permeabilidade paracelular. Nós usamos a mancha ocidental como uma técnica ortogonal para demonstrar mudanças na expressão da proteína apertada do marcador da junção, ZO-1, sobre o tempo da cultura. A expressão ZO-1 detectada via Western blotting é usada para complementar os dados do_aplicativo ly p e, em combinação, esses dados sugerem que as alterações observadas nos valores do_aplicativo ly p são refletivas da formação de uma monocamada com aumento gradual na expressão do marcador de junção apertado, ZO-1.

Como apontado mais cedo, o foco central deste trabalho é demonstrar um ensaio de ly como uma técnica simples para monitorar a formação de um monocamada confluente com junções apertadas funcionais. No entanto, para demonstrar uma utilidade adicional do ensaio desenvolvido, medimos o_aplicativo ly P em monolayers de NANOPARTÍCULAS de DNA-transfected hCMEC/D3. Os ácidos nucleicos podem ser condensados em nanopartículas de polieletrólitos com um diâmetro de 100-200 nm através da interacção ELECTROSTÁTICA entre os grupos de polímeros carregados positivamente e os grupos fosfato negativamente carregados de ácidos nucleicos^{22, 23}. nós nos referimos a esses complexos como nanopartículas de DNA (DNA NPS) em nosso trabalho. Enquanto nossa intenção é transfecção células e expressar a proteína desejada, devemos garantir que as propriedades de barreira das monocamada hcmec/D3 não estão comprometidas. Nossos dados sugerem que um regime padrão do transfection do gene da luciferase de 4 h não mude mensurável a permeabilidade de ly que demonstra a utilidade do ensaio do_app de ly P para determinar mudanças na integridade da barreira de TJ.

Protocol

cultura da pilha de 1. General hCMEC/D3 Ressuscitação de células congeladasNota: todos os experimentos e manutenção da cultura celular foram realizados dentro de uma capa de biossegurança estéril. Meios de cultura, suplementos e reagentes foram comprados como produtos estéreis ou esterilizados através de filtração usando um filtro de membrana de 0,22 μm para evitar a contaminação microbiana. Adicionar 8,5 mL de solução de colágeno (0,15 mg/mL) em um balão de cultur…

Representative Results

Primeiramente, determinamos o efeito do tempo de cultivo na permeabilidade da LY para determinar a cinética aparente da formação de TJ. Os valores médios doaplicativo ly P do dia 1 a 10-post de semeadura são mostrados na Figura 2a. No dia 1, a média de Papp foi 4,25 x 10-4 cm/min e ligeiramente caiu para 3,32 x 10-4 cm/min no dia 2. O valor médio de Papp aumentou ligeiramente para 3,93 x 10-4 …

Discussion

Um papel fundamental do BBB é impedir a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas entre a circulação sistêmica e o cérebro para manter a hemostasia do microambiente neural. Uma das características do BBB é a capacidade das células endoteliais capilares para formar junções apertadas (TJs) que efetivamente selar a rota paracelular de transporte. Nós demonstramos um teste de LY P_app como um método quantitativo para determinar a cinética aparente da formação da barreira de TJ em monolay…

Materials

hCMEC/D3 cell line	Cedarlane Laboratories	102114.3C-P25	human cerebral microvascular endothelial cell line
gWizLuc	Aldevron	5000-5001	Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt	Invitrogen	155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes	Falcon	353095
Tissue culture flask	Olympus Plastics	25-207
24-well Flat Bottom	Olympus Plastics	25-107
Black 96-Well Immuno Plates	Thermo Scientific	437111
S-MEM 1X	Gibco	1951695	Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2	Clonetics	CC-3156	Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)
phosphate-buffered saline 1X	HyClone	SH3025601
Collagen Type I	Discovery Labware, Inc.	354236
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent	Promega	E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt	Promega	E1601
SpectraMax i3	Molecular Devices		Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody	ThermoFisher	61-7300
anti-GAPDH antibody	abcam	ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)	Jackson ImmunoResearch Inc	128817
12-well, Flat Bottom	Olympus Plastics	25-106
RIPA buffer (5X)	Alfa Aesar	J62524
Aprotinin	Fisher BioReagents	BP2503-10
Odyssey CLx imager	LI-COR Biosciences		for scanning western blot membranes