تقييم المؤشرات الحيوية في الدبقي التي Immunohistochemistry على الثقافات نيوروسفيري جزءا لا يتجزأ من البارافين الدبقي 3D
Summary
نيوروسفيريس نمت كثقافات 3D تشكل أداة قوية لدراسة البيولوجيا الدبقي. نقدم هنا بروتوكولا لأداء إيمونوهيستوتشيميستري مع الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد نيوروسفيريس الدبقي عن طريق تضمين البارافين. هذا الأسلوب يتيح لتوصيف خصائص نيوروسفيري الدبقي مثل ستيمنيس وتمايز العصبية.
Abstract
تحليل التعبير البروتين في الدبقي ذات الصلة لعدة جوانب في الدراسة في علم الأمراض. قد وصفت بروتينات عديدة كالمؤشرات الحيوية مع تطبيقات في التشخيص والتشخيص والتصنيف، والدولة من تطور الورم وخلية التمييز بين الدولة. تحليل هذه المؤشرات الحيوية مفيدة أيضا لوصف الورم نيوروسفيريس (NS) التي تم إنشاؤها من المرضى الدبقي ونماذج الدبقي. NS الورم تقدم نموذجا قيماً في المختبر لتقييم ميزات مختلفة من الورم التي تستمد ويمكن أكثر دقة من مرآة الدبقي بيولوجيا. هنا يصف لنا طريقة مفصلة لتحليل المؤشرات الحيوية في ورم NS باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) على الورم جزءا لا يتجزأ من البارافين NS.
Introduction
Gliomas هي الأورام الصلبة الأولية من الجهاز العصبي المركزي مصنفة حسب خصائصها المظهرية وأوضح وفقا “منظمة الصحة العالمية”1. ويتضمن هذا التصنيف وجود أو عدم وجود برنامج تشغيل الطفرات، التي تمثل مصدرا جذاباً للمؤشرات الحيوية2. المؤشرات الحيوية هي الخصائص البيولوجية التي يمكن قياسها وتقييمها للإشارة إلى العمليات العادية والمرضية، فضلا عن الاستجابات الدوائية إلى تدخل علاجي3. ويمكن الكشف عن المؤشرات الحيوية في ورم الأنسجة والخلايا المشتقة من الدبقي، تمكين توصيفه البيولوجية في جوانب مختلفة. وتشمل بعض الأمثلة للمؤشرات الحيوية الدبقي نازعة إيسوسيتراتي تحور 1 (IDH1)، إنزيم متحولة مميزة من الصف السفلي gliomas المرتبطة بأفضل تنبؤ4. أعربت مرارا عن IDH1 تحور في تركيبة مع TP53 ومتلازمة التخلف العقلي ألفا-الثلاسيميا/العقلية المرتبطة بالعاشر (أتركس)–تعطيل الطفرات، تعريف الدبقي محددة النوع الفرعي4،5. الطفرات أتركس يخمد أيضا تحدث في 44% لطب الأطفال جليوماس عالية الجودة2،6 وارتبطت بالأورام العدوانية وعدم الاستقرار المجيني6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، يميز طب الأطفال منتشر الجوهرية البوتانية gliomas (ديبج) في مجموعات فرعية وفقا لوجود أو عدم وجود طفرة K27M في هيستون H3 جين H3F3A، أو في1،جين HIST1H3B/ج6. ولذلك، الأخذ بتوصيف جزيئي يسمح التقسيم، والدراسة، ومعاملة gliomas ككيانات منفصلة، التي سوف تسمح أكثر بتطوير أكثر يستهدف العلاج لكل نوع فرعي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل المؤشرات الحيوية لتقييم العمليات البيولوجية المختلفة مثل المبرمج8أوتوفاجي9، تقدم دورة الخلية10، خلية انتشار11وتمايز الخلايا12 .
النماذج الحيوانية المحورة وراثيا التي تأوي الآفات الوراثية موجودة في السرطانات البشرية حاسمة بالنسبة للدراسة من إشارات المسارات التي تتوسط تطور المرض. وقد نفذت مختبرنا استخدام نظام ترانسبوساسي النوم الجمال (SB) لتطوير نماذج الماوس المهندسة وراثيا من الدبقي إيواء طفرات محددة أن الخص الدبقي البشرية الأنواع الفرعية13،14. وتستخدم هذه النماذج الماوس المهندسة وراثيا لتوليد NS المستمدة من الورم، الذي تمكن في المختبر الدراسات في نظام ثلاثي الأبعاد، وتقديم النسخ المتطابق من السمات البارزة في الأورام الموقع في15. أيضا، يمكن أن تولد زرع أورثوتوبيكال NS في الفئران الأورام الثانوية التي تحتفظ بميزات الورم الرئيسي وتقليد الخصائص التشريحية المرضية والجينوم والمظهرية الورم الرئيسي الموافق15.
في ثقافة خالية من المصل، يمكن إثراء الدماغ ورم الخلايا مع خصائص الخلايا الجذعية، ووجود عوامل نمو البشرة (مماثلة)، وعوامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة)، يمكن زراعتها كمستعمرات المستمدة من خلية واحدة مثل الثقافات NS. في هذا النظام ثقافة انتقائية، معظم خلايا التفريق أو المتباينة سرعة يموت، بينما تقسيم الخلايا الجذعية وتشكيل المجموعات الخلوية. وهذا ما يسمح توليد ثقافة NS تحتفظ الدبقي الورم ميزات16،،من1718. يمكن استخدام NS الدبقي لتقييم جوانب عديدة من الأحياء الورم، بما في ذلك تحليل المؤشرات الحيوية التي لها تطبيقات في التشخيص والتشخيص والتصنيف، والدولة من تطور الورم وخلية التمييز بين الدولة. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء الدبقي NS وتضمين ثقافات 3D في البارافين لاستخدامها لتلطيخ المدينة. هي ميزة واحدة لتثبيت وترسيخ الدبقي NS مورفولوجية NS الإبقاء على أفضل مقارنة بال سيتوسبين التقليدية الأسلوب19، التي الدبقي NS يتعرضون للتلاعب المجهدة لتفكك الخلية وتصبح الأرض. وباﻹضافة إلى ذلك، تضمين يروي أي تعبير فلوروفوري الذاتية من ورم المهندسة وراثيا NS، تمكين تلطيخ عبر أطياف الفلورسنت. والهدف العام لهذا الأسلوب هو للحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد الدبقي الخلايا عن طريق بارافين تضمين عملية وتمكين توصيف نيوروسفيريس الدبقي باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نحن بالتفصيل طريقة تنوعاً واستنساخه لأداء immunohistochemistry على الدبقي جزءا لا يتجزأ من البارافين NS، التي تحافظ على هيكل ثلاثي الأبعاد المميزة للخلايا السرطانية في النمو في الدماغ في الموقع. يملك هذا الأسلوب الميزات التالية عبر استخدام خلايا مطلي على الزجاج أو الأسطح البلا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل الوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) منح R37-NS094804، R01-NS074387، R21-NS091555 إلى M.G.C.؛ تمنح المعاهد الوطنية للصحة/NINDS R01-NS076991 و R01 NS082311 R01-NS096756 P.R.L.؛ R01 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-EB022563؛ 1UO1CA224160؛ قسم جراحة الأعصاب؛ قلوب في ليا سعيدة ب M.G.C. و P.R.L.؛ و “الجيش الملكي النيبالي” الطب الحيوي منحة F046166 إلى M.G.C. F.M.M. معتمد من قبل F31 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-F31NS103500. جيه بي أيده وزارة الرياضة الأرجنتينية فولبرايت وزمالة التعليم.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
Referências
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Pesquisa do Câncer. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
