Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen
Summary
Neurosphären als 3D Kulturen angebaut sind ein mächtiges Werkzeug um Gliom Biologie zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Immunohistochemistry durchführen unter Beibehaltung der 3D-Struktur von Gliom Neurospheres durch Paraffin einbetten. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Gliom Neurosphäre Eigenschaften wie Stemness und neuronale Differenzierung.
Abstract
Analyse der Proteinexpression in Gliom ist relevant für verschiedene Aspekte in der Studie von seiner Pathologie. Zahlreiche Proteine wurden als Biomarker mit Anwendungen in der Diagnose, Prognose, Klassifizierung, Zustand der Tumorprogression und Differenzierung Zellstatus beschrieben. Diese Analysen der Biomarker eignen sich auch zur Charakterisierung der Tumor Neurosphären (NS) aus Gliom Patienten und Gliom Modelle generiert. Tumor-NS bieten eine wertvolle in-vitro- Modell, um verschiedene Funktionen des Tumors zu beurteilen, aus denen sie stammen und können genauer Spiegel Gliom Biologie. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Analyse von Biomarkern im Tumor NS mit Immunhistochemie (IHC) auf Paraffin-eingebetteten Tumor NS.
Introduction
Gliome sind primäre soliden Tumoren des zentralen Nervensystems durch ihre genotypischen und phänotypischen Merkmale gemäß der Weltgesundheitsorganisation (WHO)1eingestuft. Diese Einteilung beinhaltet das Vorhandensein oder Fehlen der Fahrer Mutationen, die eine attraktive Biomarker2darstellen. Biomarker sind biologische Merkmale, die gemessen und ausgewertet, um normale und pathologische Prozesse sowie pharmakologische Reaktionen auf eine therapeutische Intervention3zeigen werden. Biomarker können erkannt werden in Tumor-Gewebe und Zellen aus Gliom, so dass seine biologische Charakterisierung in verschiedenen Aspekten. Einige Beispiele für Gliom Biomarker mutierten Isocitrate Dehydrogenase 1 (IDH1), ein mutiertes Enzym charakteristisch für minderwertigen Gliome bessere Prognose4zugeordnet. Mutiertes IDH1 drückt sich häufig in Kombination mit TP53 und Alpha-Thalassämie/Mentale Retardierung Syndrom X-chromosomal (ATRX)-Inaktivierung Mutationen,4,5Subtyp definieren einen bestimmten Gliom. ATRX-Inaktivierung Mutationen auch in 44 % der pädiatrischen hochgradige Gliome2,6 auftreten und aggressive Tumoren und genomische Instabilität6,7zugeordnet wurden. Darüber hinaus unterscheiden sich die pädiatrische diffus intrinsische Pontinische Gliome (DIPG) in Untergruppen nach dem Vorhandensein oder Fehlen einer K27M Mutation in Histon H3 gen H3F3A oder in der HIST1H3B/C gen1,6. Daher die Einführung der molekularen Charakterisierung erlaubt die Unterteilung, Erforschung und Behandlung von Gliomen als getrennte Einheiten, wodurch mehr die Entwicklung von mehr gezielte Therapien für jeden Subtyp. Darüber hinaus kann die Analyse von Biomarkern verwendet werden, um unterschiedliche biologische Prozesse z. B. Apoptose8Autophagie9, Zellzyklus Progression10, Zelle Verbreitung11und Zelldifferenzierung12 bewerten .
Gentechnisch hergestellte Tiermodellen, die die genetischen Veränderungen im menschlichen Krebserkrankungen Hafen sind entscheidend für das Studium der Signalwege, die Progression der Erkrankung zu vermitteln. Unser Labor hat die Verwendung von Sleeping Beauty (SB) Transposase System entwickeln gentechnisch veränderter Mausmodelle der Gliom beherbergen bestimmte Mutationen, die menschlichen Gliom Subtypen13,14rekapitulieren umgesetzt. Diese gentechnisch veränderte Mausmodelle dienen zur Erzeugung von Tumor-abgeleitete NS, die in-vitro- Studien in einem 3D System ermöglichen, Spiegelung hervorstechenden Merkmale präsentieren in der Tumoren in Situ15. Die Orthotopical Transplantation von NS auf Mäuse kann auch sekundäre Tumoren generieren, die Funktionen des Primärtumors zu behalten und imitieren die histopathologischen, genomischen und phänotypischen Eigenschaften der entsprechenden Primärtumors15.
In serumfreien Kultur Gehirn-Tumor-Zellen mit Stammzellen Eigenschaften angereichert werden können, und im Beisein von epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF), können sie als einzelne Zelle abgeleitet Kolonien wie NS Kulturen angebaut werden. In diesem selektiven Kultursystem sterben die meisten differenzierende oder differenzierte Zellen schnell, während Stammzellen teilen und die zelluläre Cluster bilden. Dies ermöglicht die Erzeugung einer NS-Kultur, die Gliom Tumor Merkmale16,17,18unterhält. Gliom NS kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Tumorbiologie, einschließlich der Analyse von Biomarkern, die Anwendungen in Diagnose, Prognose, Klassifizierung, Zustand der Tumorprogression und Zellstatus Differenzierung zu bewerten. Hier haben wir ein Protokoll zum Gliom NS zu generieren und Einbinden der 3D Kulturen in Paraffin verwendet werden ausführlich für IHC beflecken. Ein Vorteil von Befestigung und Einbettung Gliom NS ist, dass die Morphologie der NS ist besser im Vergleich zu den herkömmlichen Cytospin Methode19, gepflegt, in welche Gliom NS stressig Manipulation für Zelle Dissoziation unterliegen und abgeflacht werden. Darüber hinaus stillt die Einbettung beliebiger endogenen Fluorophor Ausdruck aus gentechnisch veränderter Tumor NS, Färbung über die fluoreszierenden Spektren ermöglichen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die 3D-Struktur Gliom Zellen durch ein Paraffin einbetten Prozess erhalten und Charakterisierung von Gliom Neurospheres verwenden Immunohistochemistry zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel zeigen wir eine vielseitige und reproduzierbare Methode durchführen Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten Gliom NS, die die charakteristischen 3D-Struktur von Tumorzellen wachsen in das Gehirn in Situzu pflegen. Diese Technik besitzt die folgenden Vorteile gegenüber der Verwendung von Zellen auf Glas oder Kunststoff-Oberflächen verchromt: ich) Erhaltung der 3D-Struktur von NS; (II) Vermeidung von Stress der Zelle Dissoziation vor der Analyse der Proteinexpression; (III) abschrecken…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch nationale Institute der Gesundheit/National Institute of Neurological Disorders, R21-NS091555, M.G.C. & Schlaganfall (NIH/NINDS) Zuschüsse R37-NS094804, R01-NS074387 unterstützt; NIH/NINDS gewährt R01-NS076991 R01-NS082311 und R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; der Abteilung für Neurochirurgie; Leahs glückliche Herzen, M.G.C. und P.R.L.; und RNA Biomedizin Grant F046166, M.G.C. F.M.M. wird durch eine F31 NIH/NINDS-F31NS103500 unterstützt. J.P wurde durch ein Fulbright-argentinischen Ministerium für Sport und Bildung Stipendium unterstützt.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
Referências
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