Summary
Webbplats riktad mutagenes är en teknik som används för att införa specifika mutationer i deoxiribonukleinsyra (DNA). Det här protokollet beskriver hur man gör webbplats riktad mutagenes med en 2-steg och 3-stegs polymeras-kedjereaktion (PCR) baserat tillvägagångssätt som är tillämpliga på alla DNA-fragment av intresse.
Abstract
Webbplats riktad mutagenes är en teknik som används för att införa specifika mutationer i DNA att undersöka samspelet mellan små icke-kodande ribonukleinsyra (sRNA) molekyler och målet messenger-RNA (mRNA). Dessutom används webbplats riktad mutagenes att mappa specifika protein bindningsställen till RNA. En 2-steg och 3 PCR-baserade införandet av mutationer beskrivs. Metoden är relevant för alla protein-RNA och RNA-RNA interaktionsstudier. Kort sagt, bygger tekniken på utforma grundfärger med den önskade Function"-mutation(er), och genom 2 eller 3 steg av PCR syntetisera en PCR produkt med mutationen. PCR-produkten används sedan för kloning. Här beskriver vi hur du utför webbplats riktad mutagenes med både 2 - och 3-stegs metoden att introducera mutationer i sRNA, McaS och mRNA, csgD, att undersöka RNA-RNA och RNA-protein interaktioner. Vi tillämpar denna teknik för att undersöka RNA interaktioner; tekniken är dock tillämpliga på alla mutagenes studier (t.ex. DNA-protein interaktioner, aminosyra ersättning/borttagning/tillägg). Det är möjligt att införa någon typ av mutation utom icke naturliga baser men tekniken är endast tillämplig om en PCR-produkten kan användas för efterföljande ansökan (t.ex. kloning och mall för ytterligare PCR).
Introduction
DNA benämns ofta som blåkopian för en levande cell eftersom alla strukturer i cellen är kodade i sekvensen av dess DNA. Exakt replikering och DNA-reparationsmekanismer säkerställa att endast mycket låga priser av mutationer förekommer, vilket är viktigt för att upprätthålla rätt funktioner kodade gener. Förändringar i DNA-sekvensen kan påverka efterföljande funktioner på olika nivåer börjar med DNA (erkännande av transkriptionsfaktorer och restriktionsenzym), sedan RNA (baspar komplementaritet och sekundärt strukturera förändringar) och/eller protein (aminosyror sura substitutioner, borttagningar, tillägg eller ram-skift). Medan många mutationer inte påverkar geners funktion väsentligt, kan vissa mutationer i DNA har enorma konsekvenser. Således, webbplats riktad mutagenes är ett värdefullt verktyg för att studera betydelsen av specifika DNA webbplatser på alla nivåer.
Det här protokollet beskriver en riktad mutagenes strategi används för att införa specifika mutationer. Protokollet bygger på två olika PCR strategier: en 2-steg eller en 3-stegs PCR. 2-stegs PCR är tillämplig om önskad mutationen är nära slutet 5' eller 3' ände DNA av intresse (< 200 baspar (bp) från slutet) och 3-stegs PCR är tillämplig i alla fall.
I 2-steg närma sig PCR, 3 grundfärger är utformade, där en uppsättning primers är utformad för att förstärka DNA av intresse (grundfärger 1 och 3, framåt och bakåt, respektive), och en enda primer är utformad för att inkorporera mutationen. Mutationen att införa grundfärg (primer 2) bör ha en omvänd läggning om mutationen är nära slutet 5' och en framåt orientering om mutationen är nära slutet 3'. I det första steget för PCR förstärker primer 1 + 2 eller 2 + 3 ett litet fragment nära 5' slutet eller 3' slutet, respektive. PCR-produkten används sedan som en primer i steg två med primer 1 eller 3, vilket resulterar i en PCR-produkt med en mutation i DNA av intresse (figur 1A).
I 3-steg PCR, 4 primers är utformade, där en uppsättning primers är utformad för att förstärka DNA av intresse (grundfärger 1 och 4, framåt och bakåt, respektive) och en uppsättning primers är utformad för att inkorporera specifika mutationer med överlappande komplementaritet (primers 2 och 3, bakåt och framåt, respektive). I steg ett och två, grundfärger 1 + 2 och 3 + 4 förstärker 5' och 3' slutet. I steg tre, de resulterande PCR produkterna från steg ett och två används som mallar och förstärks med grundfärg 1 + 4. PCR-produkten alltså DNA av intresse med önskad mutationen (figur 1B).
Medan muterad DNA kan användas för alla efterföljande program, beskriver det här protokollet hur du kombinerar nytt DNA i en kloning vektor. Användningen av kloning vektorer har flera fördelar såsom användarvänlighet kloning och specifika experimentella tillämpningar beroende på funktioner av vektorn. Den här funktionen används ofta för RNA interaktionsstudier. En annan teknik för RNA interaktionsstudier är strukturella sondering av RNA i komplex med en annan RNA1,2 eller protein3,4. Men utförs strukturella sondera endast in vitro-medan webbplats riktad mutagenes och efterföljande kloning tillåter interaktionsstudier in vivo.
Webbplats riktad mutagenes har i stor utsträckning använts för RNA interaktionsstudier som presenteras här. Men den viktigaste metoden angående 2 - eller 3-steg PCR är tillämplig på någon bit av DNA och därmed inte bara begränsat till RNA-interaktionsstudier.
För att exemplifiera tekniken och dess möjliga användningsområden, används karakterisering av regioner som är viktiga för post-transcriptional reglering av mRNA, csgD, av Escherichia coli (E. coli). E. coli, csgD riktas av små icke-kodande RNA, McaS, i samarbete med ett protein, Hfq, att förtränga protein-uttryck av CsgD2,4,5. Tekniken används för att introducera mutationer att regionen base-ihopkoppling mellan csgD och McaS och Hfq bindande platsen för csgD. Den erhållna DNA är sedan klonade in en vektor som lämpar sig för efterföljande experiment. Nedströms tillämpningar av tekniken inkluderar både in vivo och in vitro-experiment. För illustration, exempel 1 kännetecknas i vivo med en western blot-analys och exempel 2 kännetecknas in vitro-med en elektroforetiska mobilitet Skift-analys (EMSA). I båda fallen är det illustrerade hur platsen riktad mutagenes kan användas i kombination med andra tekniker för att göra biologiska slutsatser om en gen av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vector urval
- Välja en vektor att utföra nedströms experiment med. Varje vektor är tillämplig för denna 2 - och 3-stegs PCR-metod.
- Baserat på valet av vektor, välja lämpliga restriktionsenzym för kloning.
2. primer design för webbplatsen riktad mutagenes
- Välja mellan antingen 2-steg eller 3 PCR-strategin (2-steg är endast för mutationer < 200 bp från vardera änden av DNA av intresse). För 2-stegs PCR, gå till steg 2.2 och 3-stegs PCR går du till steg 2,3.
- Design primers för PCR-2-steg.
- Design primer 1 och 3 att förstärka DNA av intresse och med en 5' överhäng som innehåller 4 nukleotider (t.ex. UVERSE eller AGCT) följt av relevanta begränsningar erkännande webbplatsen nödvändigt att klona i den valda vektorn.
- Design primer 2 att införa Function"-mutation(er) på önskad industriområden och flankerar mutationen med 10-15 kompletterande nukleotider på båda sidor. Gör primern omvänd om mutationen introduceras i slutet 5' eller vidarebefordra om mutationen introduceras i slutet 3'.
- Design primers för PCR-3-steg.
- Design primer 1 och 4 att förstärka DNA av intresse och med en 5' överhäng som innehåller 4 nukleotider (t.ex. UVERSE eller AGCT) följt av relevanta begränsningar erkännande webbplatsen nödvändigt att klona i den valda vektorn.
- Design primer 2 och 3 att införa Function"-mutation(er) på önskad plats och flankerar mutationen av 10-15 kompletterande nukleotider på båda sidor. Primer 2 och 3 är omvänd kompletterande.
3. PCR-amplifiering av wild typ DNA för kloning
Obs: För information om PCR, se6.
- Utför PCR-6 använda primers 1 + 2 (2-steg PCR) eller 1 + 4 (3-steg PCR) och använda wild type-DNA som mall för att få PCR-produkten I. använda PCR-programmet i tabell 1.
- Validera PCR av agaros gelelektrofores.
- Göra en agaros gel lösning (2%) genom att lägga 2 g av agaros per 100 mL 1 x Tris-acetat-etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA) (TAE) buffert. Lös upp Agarens genom kokning i en mikrovågsugn. Lägg till den DNA-färgning dye etidiumbromid (till en slutlig koncentration av ~ 0,5 µg/mL) till agarosen gel lösning för visualisering.
- Gjutna agarosgel, placera den i en elektrofores-enhet och ladda PCR prov (blandat med DNA lastning färgämne) och en DNA stege av kända storlek. Köra prover på 75 W för 45 min, eller tills band separeras tillräckligt och visualisera band på en ultraviolett (UV)-tabell eller med en gel som tänkbar system.
- Rena PCR-produkten med en gel extraction kit (Tabell av material) och mätning av koncentrationen av renade DNA med en spektrofotometer (Tabell för material).
- Lagra den renade DNA vid-20 ° C (i Tris-EDTA (TE) buffert – lång sikt lagring) eller 4 ° C (i dH2O – kort sikt lagring) tills används i steg 5.
4. PCR att införa webbplats riktad mutationer i DNA
- PCR för 2-stegs PCR (se steg 4,2 för 3-steg PCR)
- Utföra PCR6 använda primers 1 + 2 om mutationer i slutet 5' eller 2 + 3 om mutationer i 3na ' slut och använda wild type-DNA som mall för att få PCR-produkt II (se tabell 1 för PCR-program).
- Validera PCR av agaros gel-elektrofores som i steg 3.2.1 och 3.2.2.
- Rena PCR-produkten med en gel extraction kit (Tabell av material) och mätning av koncentrationen av renade DNA med en spektrofotometer (Tabell för material).
- Store renade DNA vid-20 ° C (i TE buffert) eller 4 ° C (i dH2O) tills används i steg 5.
- Utföra PCR6 använder PCR-produkt II som primer tillsammans med primer 3 om mutationer är 5' slutet eller primer 1 om mutationer i slutändan 3' och använda wild type-DNA som mall att få PCR-produkt III (se tabell 1 för PCR-program).
- Validera PCR av agaros gel-elektrofores som i steg 3.2.1 och 3.2.2.
- Rena PCR-produkt med en gel extraction kit (Tabell av material) och mäta koncentrationen av renade DNA med en spektrofotometer (Tabell för material).
- Store renade DNA vid-20 ° C (i TE buffert) eller 4 ° C (i dH2O) fram till steg 5.
- PCR för 3-steg PCR
- Utför PCR-6 använda primers 1 + 2 och 3 + 4 i separata reaktioner och använda wild type-DNA som mall för att få PCR-produkt II och III (se tabell 1 för PCR-program).
- Validera primärvården av agaros gel-elektrofores som i steg 3.2.1 och 3.2.2.
- Rena PCR-produkter med en gel extraction kit (Tabell av material) och mätning av koncentrationen av renade DNA med en spektrofotometer (Tabell för material).
- Store renade DNA vid-20 ° C (i TE buffert) eller 4 ° C (i dH2O).
- Utför PCR-6 använda primers 1 + 4 och använda 2-5 ng av båda PCR produkter II och III som mallarna (i samma reaktion) att få PCR-produkt IV (se tabell 1 för PCR-program).
- Validera PCR av agaros gel-elektrofores som i steg 3.2.1 och 3.2.2.
Obs: Det är inte ovanligt att få flera felaktiga band (kan ibland minskas med mindre mall). De felaktiga PCR-produkterna kan dock ignoreras om rätt storlek bandet är censurerade och gel-extraherade. - Om korrekt, rena PCR-produkt med en gel extraction kit (Tabell av material) och mäta koncentrationen av renade DNA med en spektrofotometer (Tabell för material).
- Store renade DNA vid-20 ° C (i TE buffert) eller 4 ° C (i dH2O) fram till steg 5.
5. rekombination av vildtyp och muterade versioner av DNA i den valda vektorn
Anmärkning: För information om följande steg, se7.
- Digest renat PCR-produkter I och III (från 2-steg PCR) eller IV (från 3-steg PCR) använder de relevanta restriktionsenzym.
- I 20 µL av 1 x matsmältningen buffert med 1 µL av varje restriktionsenzym, smälta 200 ng av PCR-produkten vid 37 ° C i 30-60 min.
- Rena smält PCR-produkten av gel-extraktion med en gel utvinning kit (Tabell för material), mätning av DNA koncentrationen av renade DNA med en spektrofotometer (Tabell av material) och förvaras vid-20 ° C (i TE buffert) eller 4 ° C (i dH2 O) tills används för steg 5,6.
- Smälta renat vector med relevanta restriktionsenzym och behandla med alkaliskt fosfatas minska vektor ny ligatur händelser. Behandla inte PCR-produkter med alkaliskt fosfatas.
- I 30 µL 1 x matsmältningen buffert med 1 µL av varje restriktionsenzym och 1 µL alkalisk fosfatas, digest 1000 ng av vektor vid 37 ° C i 30-60 min.
- Separat smält vektor från avfall DNA (t.ex. uncut vektor och utstansade DNA) använda agaros gel-elektrofores som i steg 3.2.1 och 3.2.2.
- Rena smält vektor genom gel-extraktion med en gel utvinning kit (Tabell för material), mäta DNA-koncentration av renade DNA med en spektrofotometer (Tabell av material) och förvaras vid-20 ° C (i TE buffert) eller 4 ° C (i dH2O) tills för steg 5,6.
- Ligera smält PCR-produkter i smält vektor med de reaktioner som anges i tabell 2.
- Odla i rumstemperatur för 2 h eller övernattning på 16 ° C.
- Omvandla mottagarens stam (t.ex. E. coli K12) med ligering reaktioner.
- Växa stam till OD600= 0,3-0,5 och överföra en 1 mL kultur så många 1,5 mL rör som ligase reaktioner.
- Snurra på 3 500 x g i 5 min och Kassera supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i 200 μL av omvandling buffert (10 mL lysogeny buljong (LB) med 0,1 g/mL polyetylenglykol 3350, 5% dimethyl sulfat och 20 mM MgCl2).
- Lägg till ligatur reaktion och placera rören på is i 30 min.
- Värme-chock för 2 min på 42 ° C.
- Tillsätt 1 mL LB till 1,5 mL tuberna och tillåta fenotypisk expression av antibiotikaresistens minst 45 minuter vid 37 ° C.
- Snurra cellerna vid 3 500 x g i 5 min, kassera 1 mL av supernatanten och återsuspendera cellerna i återstående supernatanten.
- Platta celler på tallrikar med lämpliga antibiotika och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Identifiera transformants härbärgerat vektorer med framgångsrik integration av DNA Infoga (t.ex. genom PCR använder vektor - och infoga-specifika primrar).
- Validera sekvens av DNA av sanger sekvensering.
Varning: Använd inte samma primers för sekvensering som används för steg 5,9.
6. använda Byggyta vektorer för in vitro- eller in vivo-experiment
- In vivo experiment
Obs: Detta är ett exempel på användning en vektor för att uttrycka vildtyp/muterade RNA att karakterisera post-transcriptional förordning. För ytterligare information om western blotting, se8.- Växer E. coli K12 stammar med Byggyta vektorer i lämpligt medium och inducerar uttryck om det behövs. Skörda prover genom centrifugering.
- Förbereda prover för sodium dodecyl sulfate – polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) genom upplösning cell pellets 1 x SDS prov buffert (62,5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% SDS, 0,002% bromophenol blå, 5% β-merkaptoetanol, 10% glycerol) och koka vid 95 ° C i 5 min.
Obs: Det är möjligt att kasta en gel eller använder en kommersiellt tillgänglig förtillverkade gel. De senare användes i de resultat som presenteras i figur 3 (Tabell för material). - 107 lastceller av varje prov i separata brunnar (inkluderar en protein stege) och köra gel på 200 V tills proteinerna separeras (ca 45 min).
- Blot proteinerna på cellulosa-membran genom halvtorr överföring på 80 mA för 1 h.
- Blockera membranet med en blandning av proteiner (t.ex. 5% mjölk-pulver löses i 1 x Tween 20-Tris-buffrad koksaltlösning (TTBS) buffert).
- Lägg till primär antikropp (upplöst i 1 x TTBS buffert) som rikta proteinet av intresse (t.ex. GFP-, flagg- eller HIS-taggade protein) och inkubera i 1 h med försiktig skakning.
- Tvätta membran i 1 x TTBS för 10 min bort obundna antikroppar. Upprepa två gånger mer.
- Lägg till sekundära antikroppar (upplöst i 1 x TTBS buffert) riktar sig till de primära antikropparna och möjliggör identifiering (t.ex. pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundära antikroppar. Inkubera i 1 h med försiktig skakning.
- Tvätta membranet i 1 x TTBS för 10 min bort obundna antikroppar. Upprepa två gånger mer.
- Visualisera membranet med en teknik som är kompatibel med de sekundära antikropparna (t.ex. genom avbildning efter inkubation med en urin-derived chemiluminescence, om en sekundär HRP-konjugerad antikropp användes).
- In vitro experiment
Obs: Detta är ett exempel på med vektorn som en mall för in vitro-transkription av RNA för att karakterisera RNA-protein interaktioner. För ytterligare information om EMSA, se9.- Göra in vitro-utskrifter med en T7 i vitro transcription kit (Tabell av material) och vektorer från steg 5 som mallar.
- Separera RNA avskrifter av på en 4,5% 7 M urea denatureringen gel, och extrahera RNA direkt från gelen genom elektronisk eluering med dialys rör (Tabell för material).
- Etikett RNA (t.ex. radiolabeling med γ -32P-ATP med hjälp av T4-polynucleotide kinase (Tabell av material) och rena igen med kolumner (Tabell för material).
FÖRSIKTIGHET: Innan du arbetar med radioaktivt material, rådgör med den lokala ansvariga föreståndaren. - Blanda märkt-RNA med ökande koncentrationer av protein i separata reaktioner i 1 x bindande buffert (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM Ditiotreitol (DTT)).
Obs: I de presenterade resultaten (figur 4), 2 nM av radiomärkt csgD mRNA blandades med en gradient av 0 till 2 µM Hfq protein (monomer koncentration). - Tillåta proteiner och RNA att hybridisera före lastning hybridisering mix på en icke-denatureringen polyakrylamidgel och kör gelen för 1,5 h på 200 V.
- Visualisera gelen med en teknik som är kompatibel med märkning från steg 6.1.3. (t.ex. genom phosphoimaging om radiolabeling tillämpades).
- Kvantifiera relativa intensiteten av de skiftade band med en tänkbar program bearbetning och passa en kurva (sigmoidal) till data med hjälp av en graf och data analys programvara (Tabell för material). Baserat på monterade kurvan, kan dissociation konstantvärden (Kd) bestämmas automatiskt med programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att undersöka RNA interaktioner angående post-transcriptional reglering av csgD, en dubbel vektor setup valdes: en att uttrycka den csgD mRNA och en annan för att uttrycka små icke-kodande RNA, McaS. csgD var klonade in pBAD33, som är en arabinos inducerbara medium-kopia plasmid med kloramfenikol motstånd och McaS var klonade in mini R1-pNDM220, som är en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbara låg kopia plasmid med ampicillin-resistens. Vildtyp csgD var PCR amplifieras med primers 1A och 4A (4A inkluderar en flagga-sekvens) att ge PCR-produkt IA, medan vildtyp McaS var PCR amplifieras med primers 1B och 4B för att ge PCR-produkten IB. 3-steg PCR strategin användes för att introducera substitutioner i regionen förutspådda base-ihopkoppling av csgD och McaS. I de två första stegen, var PCR-produkter IIA och IIIA syntetiseras med primers 1A, 2A och 3A + 4A, respektive. I det tredje steget, var PCR-produkten IVA syntetiseras med PCR-produkter IIA och IIIA som mall och 1A och 4A som primers (figur 2A). Likaså infördes kompletterande webbplats riktad mutationer i McaS, använda primers 1B, 2B, 3B och 4B avkastning PCR-produkter IIB, IIIB i de första två stegen och IVB i det tredje steget (figur 2A). pBAD33 och PCR-produkter IA och IVA var smält med både BamHI och PstI och den smälta IA och IVA var sammanskrivna i smält pBAD33. Resulterande konstruktioner namngavs pBAD-csgDflagga och pBAD-csgD63-66FLAG (muterade på plats 63-66 i förhållande till webbplatsen transkriptionell start). pNDM220 och PCR-produkter IB och IVB var smält med AatII och BamHI och smält IB och IVB var sammanskrivna i smält pNDM220. Resulterande konstruktioner namngavs pNDM-mcaS och pNDM-mcaS42-45 (muterade vid position 42-45 jämfört med transkriptionell startwebbplats).
För att analys av mutationer, odlades E. coli -stammar som härbärgerat pBAD-csgDflagga eller pBAD-csgD63-66FLAG och pNDM220, pNDM-mcaS eller pNDM-McaS42-45 i M9 minimalmedium kompletteras med 0,2% glycerol att OD 450 av 0,4. Uttryck från pNDM-vektorerna förmåddes då för 10 min genom tillsats av 1 mM IPTG följt av 5 min induktion av pBAD-vektorer genom tillsats av 1 mM arabinos. Vid denna punkt, prover skördades och western blot analys utfördes med skördade prover. Medan uttryck för vildtyp McaS förhindrar översättning av vildtyp CsgD, lindrar införandet av mutationer i antingen CsgD eller McaS observerade förtrycket. Men när mutationerna kompletteras i både CsgD och McaS translationell förtrycket av CsgD återställs (figur 3, modifierad från2). Således stöder metoden webbplats riktad mutationsanalys hypotesen att McaS och csgD -baspar vid denna region.
PBAD33 vector valdes för Invivo experimentet, och användes också för att införa webbplats riktad mutation för att undersöka Hfq-bindning till csgD mRNA in vitro. Webbplats-regisserad mutationer infördes med 2-stegs PCR-strategi för att generera csgD mutant RNAs med förändrad primära eller sekundära strukturer när transkriberas. Grundfärger 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F och 2G användes för att förstärka och introducera mutationer till 5' slutet av csgD. De resulterande PCR-produkterna (IIC, IID, IIE, OOM och IIG) användes som mallar med primer 3 att förstärka och introducera mutationer till den hela csgD DNA (figur 2B). De resulterande PCR-produkterna (IIIC, IIID, IIIE, IIIF och IIIG) var klonade in pBAD33 som beskrivs ovan. In vitro avskrifter var transkriberas med den T7 RNA-polymerasen: första PCR-produkter var syntetiseras med primers 5A, 5C, 5D, 5E, 5F eller 5 g + 6 med Byggyta vektorer som mall. De resulterande PCR-produkterna användes som mallar för den T7 RNA-polymerasen. In vitro-transkriberat csgD vildtyp och mutant RNAs var renat, radiomärkt och blandade med ökande koncentrationer av renat Hfq. Hybridisering reaktionerna var köras på icke-denatureringen geler och visualiseras. Den öka Kd-värden de muterade alleler bevisar att Hfq mindre effektivt binder till mutanter. Hfq har dessutom flera bindningsställen på csgD som visas av de 3 Skift som observerats för den vilda typen RNA. Dock endast 2 bindningsställen observeras för olika muterade RNAs (figur 4, modifierad från4). Således den webbplats riktad mutationsanalys strategin identifierar primära eller sekundära strukturer av den csgD mRNA som är viktiga för komplett bindningen av Hfq.
Sammantaget är det möjligt att utföra webbplats riktad mutagenes med en 2 - eller 3-steg PCR-metod i kombination med efterföljande analyser att göra biologiska slutsatser om genreglering vid den post-transcriptional nivå samt protein-RNA interaktioner .
| Steg | Temperatur | Tid |
| Inledande denaturering | 98° C | 2 min |
| Denaturering | 98° C | 10 s |
| Glödgning | 55° C | 10 s |
| Förlängning | 72° C | 15 s |
| (30 cykler) | ||
| Slutliga förlängning | 72° C | 5 min |
| Håll | 4 ° C |
Tabell 1: PCR-program
| Reagens | Kontrollreaktionen | 20 fmol reaktion | 100 fmol reaktion |
| 10 x ligase buffert | 2 ΜL | 2 ΜL | 2 ΜL |
| Rötas vektor-DNA | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Smält PCR-produkten | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | Till 19 µL | Till 19 µL | Till 19 µL |
| Ligase | 1 ΜL | 1 ΜL | 1 ΜL |
Tabell 2: Ligering reaktioner
| Primer namn | Sekvens | Används för - mutationer | ||
| 2-1A eller 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - och 3-runda PCR på csgD | ||
| 2-3A eller 3-4A | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - och 3-runda PCR på csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3-runda PCR på csgD – ersätter 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3-runda PCR på csgD – ersätter 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-runda PCR på McaS | ||
| 3-4B | KOSBAZIGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-runda PCR på McaS | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3-runda PCR på McaS – ersätter 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3-runda PCR på McaS – ersätter 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-runda PCR på csgD – tar bort 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runda PCR på csgD – ersätter 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runda PCR på csgD – tar bort 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-runda PCR på csgD – tar bort 9 nt och substitut 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-runda PCR på csgD – tar bort 9 nt och substitut 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tabell 3: Primers används för webbplats riktad mutagenes och T7 mall syntes
Djärv: restriktionsenzym erkännande platser (BamHI, PstI och AatII)
Understruket: nukleotid mutationer
Figur 1: PCR strategi för webbplats riktad mutagenes. (A) tre primers används i 2-steg närma sig PCR för att införa webbplats riktad mutationer till en gen av intresse. Grundfärger 1 och 3 förstärker genen (PCR-produkten jag), medan primer 2 introducerar specifika mutationer (*). Primer par 1 + 2 förstärker ett litet fragment i vardera änden av DNA av intresse att syntetisera PCR-produkten II (steg 1). PCR-produkten används sedan som en primer tillsammans med primer 3 för att syntetisera PCR-produkten III med webbplats riktad mutationen införlivas (steg 2). (B) fyra grundfärger används i 3-steg närma sig PCR för att införa webbplats riktad mutationer till en gen av intresse. Grundfärger 1 och 4 förstärker genen (PCR-produkten jag), medan primers 2 och 3 introducerar specifika mutationer (*). Primer par 1 + 2 och 3 + 4 används i de två första stegen av PCR för att syntetisera PCR-produkten II och III (steg 1 & 2). I det tredje steget används PCR-produkter II och III som mall med primer par 1 + 4 för att syntetisera PCR-produkt IV med webbplats-regisserad mutationen införlivas (steg 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: PCR produkter från webbplatsen riktad mutagenes. Primärvården utfördes med primers och mallar som beskrivs i texten. PCR-produkter som kördes på en 2% agarosgel med etidiumbromid (~ 0,5 µg/mL) med 1 µg av DNA stege blanda (Tabell för material). Rätt storlek band är markerade med en röd fyrkant. (A) i de flesta PCR reaktioner syns endast ett musikband av rätt storlek. PCR-reaktionen IVB har dock två synliga band varav det övre bandet (precis ovanför 300 bp) har rätt längd. Som förväntat, summan av längden på PCR-produkter II och III c lika med längden av PCR-produkter I och IV (A: csgD PCR-produkter, B: McaS PCR produkter, I: vildtyp csgD/McaS förstärks med hjälp av primers 1A/B + 4A/B, II + III: mellanliggande PCR-produkter förstärkt med primers 1A/B + 2A/B och 3A/B + 4A/B, respektive, IV: muterade PCR-produkt förstärkt med primers 1A/B + 4A/B med PCR mellanprodukterna II och III som mallar). I alla PCR reaktioner syns endast ett musikband av rätt storlek. I det här fallet användes nästan alla molekyler av PCR produkter II PCR-reaktioner III att syntetisera PCR-produkter III. Endast för PCR IIIE är PCR-produkten IIE fortfarande synliga (IA: vildtyp csgD PCR-produkt förstärkt med primer 1A + 3A, IIC-G: mellanprodukter PCR amplifieras använder primer 1A + 2 C-G, IIIC-G: muterade PCR produkter amplifieras med PCR-produkter IA primer 3A (och IIC-G som mallar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: In vivo experiment med webbplats-riktade csgD och McaS mutanter. Western blot analys av stammar som härbärgerat anges vektorer. Stammar var vuxit till exponentiell fas och inducerad för 10 min med 1 mM IPTG (McaS) följt av 5 min induktion med 1 mM arabinos (csgD). Α-flaggan antikroppar användes för att rikta den flaggan-märkta CsgD och α-GroEL antikroppar användes att rikta städning proteinet GroEL (utspädd 10 000 och 50 000 gånger, respektive). Mus och kanin HRP-konjugerade antikroppar användes som sekundära antikroppar (utspädd 2 000 gånger). Denna siffra har ändrats från2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: In vitro experiment med webbplats-riktade csgD mutanter. EMSA av in vitro-transkriberas csgD vildtyp (WT) och mutant Panel C-G RNAs avseende Hfq bindande. De csgD allelerna (WT och mutant C-G) var radioaktivt och blandas med 0, 0,25, 0,5, 1 eller 2 µM monomer Hfq. hybridisering reaktioner kördes på icke-denatureringen polyakrylamidgeler. Relativ intensitet av de skiftade band kvantifierades och en sigmoideum kurva var monterade på data. Dissociation konstanta (Kd) värden bestämdes med hjälp av SigmaPlot. Denna siffra har ändrats från4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Webbplats riktad mutagenes har ett brett utbud av olika program, och här, representativa resultat från en in vivo och in vitro-experiment ingick som exempel på hur man gör biologiska slutsatser med hjälp av tekniken. Webbplats riktad mutagenes har länge varit den gyllengula standarden för RNA interaktionsstudier. Styrkan i tekniken ligger i kombinationen av att införa relevanta mutationer med efterföljande analyser och experiment (western blot eller EMSA) att dra slutsatser om specifika DNA webbplatser och deras betydelse i funktioner av gen-produkter i fråga. Vid beslut att göra webbplats riktad mutagenes, utformningen av primers bör planeras noga att vinna mest på tekniken (t.ex. vilka webbplatser att mutera); Glöm inte att inkludera rätt överhäng och begränsning platser och uppmärksamma de primer/mall egenskaperna.
Den faktiska mutagenes som beskrivs i detta protokoll är beroende av PCR. Den mest avgörande delen av protokollet är därför villkoren för detta. I området i närheten finns det flera sätt att optimera PCR, inklusive toningar av Mg2 + koncentrationer, DMSO koncentration och temperaturer av glödgning steg. För ytterligare detaljer, se3. Förutom optimering av PCR-reaktionen själv, två saker är värda att göra säker när man gör webbplats riktad mutagenes: hög kvalitet mallar och noggrant utformad primers.
Att ha en hög kvalitet mall för PCR ofta gör skillnaden mellan en misslyckade och lyckade PCR. Det är möjligt att använda en cell lysate för att ge mallen DNA, renade DNA (genetiska-, vektor- eller PCR-DNA) är alltid att föredra. Dessutom när det kommer till mängden mall, är ofta mindre mer; särskilt i det sista steget i 3-steg PCR (steg 4.2.5). Exempelvis försök en 10 x spädningsserien för mall för att hitta optimaln vid behov.
Optimal primer design beror på egenskaper hos DNA i intresse och polymeras. Om möjligt försök alltid designa grundfärger med detta. Men i många fall primers måste utformas på en specifik plats och kan därför inte utformas enligt särskilda kriterier. I dessa fall kan det vara nödvändigt att göra mer optimering av PCR villkor istället (se ovan och protokollet om PCR-6), men med rätt förutsättningar även svårt primärvården är oftast framgångsrik.
Flera alternativa metoder för webbplats riktad mutagenes finns tillgängliga, såsom Kunkels metod10, hela plasmid mutagenes11, kassett mutagenes12, de novo gen syntes och CRISPR13,14.
Kunkels metod och hela plasmid mutagenes förlitar sig på DNA av intresse redan vara i en plasmid (vector) och använder primer för att syntetisera en enda strand eller dubbel strand av muterad DNA, respektive. I båda teknikerna är hela plasmiden syntetiskt och används för omvandling, medan 2 - eller 3-steg PCR endast syntetiserar DNA lappa av intresse. En nackdel av det 2 - eller 3-steget PCR, är att DNA av intresse måste syntetiseras två gånger, ökar risken för mutationer däri. Däremot, behöver plasmiden inte syntetiseras, därmed sänka risken för mutationer här istället. Dessutom behöver använder det 2 - eller 3-steget PCR, en vildtyp variant inte klonas i en vektor i förväg, sålunda sänkanden kloning tiden av flera dagar.
Kassetten mutagenes förlitar sig inte på användningen av grundfärger eller polymeraser. En liten DNA-fragment är istället de novo syntetiseras och införlivas med intresse DNA med restriktionsenzym. Denna metod är dock beroende av närvaron av lämplig begränsning platser nära riktade webbplatsen, vilka inte är alltid närvarande. Detta tillvägagångssätt kräver också vildtyp varianten att klonas i vektorn i förväg, öka kloning tid jämfört med 2 - eller 3-steg PCR metoden.
Med minskande kostnaden för de novo gen syntes (stor DNA-fragment) blir det allt mer prisvärt att introducera mutationer genom att beställa önskade sekvensen kommersiellt. Denna metod är dock fortfarande kostsamt jämfört med de andra metoderna som nämns. Vid skrivande stund de novo är syntesen ca 3 gånger dyrare än metoden presenteras här.
Ett annat framväxande alternativ är den efterlängtade CRISPR-metoden för genomet ombyggnad. Denna metod är mycket effektiv och anpassningsbar jämfört med andra tekniker som används för eukaryota celler. Dock med den relativa lätthet och många tillgängliga tekniker för kloning i enklare organismen som bakterier, är CRISPR sällan mer lämplig än konventionella kloning. Nyttan av CRISPR beror alltså, mestadels på organismen som studeras.
När du väljer att göra webbplats riktad mutagenes, är det viktigt att utforma det noggrant; både när det gäller nedströms tillämpningar samt den faktiska tekniken används. 2 - och 3-stegs PCR-metoden som beskrivs här gäller nästan alla undersökning av genmutation och med dess låga kostnader är det lämpligt att varje laboratorium budget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Syddansk Universitet öppna politiska bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
