Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma
Summary
Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.
Abstract
Bu protokol için ultrasantrifüj ya da gelişigüzel kullanımı olmadan U937 hücrelerinin hücre altı fraksiyonları elde etmek için bir yöntem ayrıntı. Bu yöntem hipotonik arabellekleri, digitonin, mekanik lizis ve sitoplazma, mitokondri ve plazma zarı izole etmek için fark Santrifüjü kullanır. Bu işlem araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için ölçeklendirilebilir, ucuz ve basit. Bu yöntem araştırmacılar protein yerelleştirme hücrelerdeki özel santrifüjler ve ticari kitleri, bunların her ikisi de çok pahalı olabilir kullanımı olmadan belirlemek için izin verir. Biz başarıyla bu yöntemi sitozolik ayırmak için plazma zarı ve mitokondrial proteinler insan monosit hücre kültürünü U937 kullandık.
Introduction
Protein yerelleştirme güvenilir kimlik kez ökaryotik hücrelerde moleküler yolları incelerken gerekli değildir. Hücre altı fraksiyonları edinme yöntemleri ilgi hücresel bileşenleri daha yakından incelemek için araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır.
Varolan hücre ayırma yöntemleri çoğunluğu genellikle iki geniş kategoriye, deterjan tabanlı1,2 ve hangi-ebilmek var olmak ultrasantrifüj tabanlı3,4,5, ayrılır hızlı, hassas ve maliyet tarafından ayrıştırılan. Deterjan tabanlı protokolleri ile hücrenin farklı bileşenleri solubilize için deterjan gücü artan arabellek kullanımını güveniyor. Bu işleme örnekleri için hızlı ve uygun bir yöntem ve maliyet örnekleri boyutunu ve sayısını küçük iseniz etkili olabilir. Deterjan tabanlı kitleri sitoplazmik, membran/organel (karışık fraksiyonu) ve nükleer kesirler hücreleri izole etmek için satın alınabilir. Ancak, bu kitleri ile ilişkili çeşitli sakıncaları kullanışlılığı araştırmacılar için sınırı. Onlar kolayca bir veya iki bileşen hücrenin yalıtmak için tasarlanmıştır, ama aynı anda bir örnek üzerinden tüm kesirler yalıtma aciz. Plazma zarı ve organelleri membran içine eşit çözündürüldükten ki deterjan kullanımı anlamına gelir ve bu nedenle, birbirinden ayrılması için. Araştırmacılar koşulları belirli uygulamalar için değiştirmesini engelleyen bu kitleri özel bileşenler ek bir komplikasyon kaynaklanmaktadır. Son olarak, kullanım sayısı sınırlı ve daha büyük ölçekli deneyler için çok pahalı olabilir. Mitokondri yalıtım için sigara-deterjan tabanlı kitleri var, ancak, bunlar plazma zarı yalıtmak için tasarlanmamıştır ve örnek verim önemli ölçüde yoğunluğu Santrifüjü bundan daha az yalıtım protokolleri6,7 dayalı .
Ultrasantrifüj kesirler edinmek yararlanın yöntemleri vardır daha fazla zaman tüketmek, ama sık sık deterjan tabanlı kitleri daha saf kesirler sonuçlanabilir. Plazma membran hücrelerden olmadan ilk onları (kirlenme membran organelleri ile sonuçlanan) çözücü yalıtmak için ayrılması hücresel bileşenleri ile fark tarafından takip bir deterjan yöntemi tarafından lysed etmelerini gerektirir Santrifüjü — gerçekleştirmek için 100.000 × g hızına gerektiren plazma membran izolasyon ile. Birçok durumda, farklı aralıklarla isopycnic yoğunluğu degrade Santrifüjü hücresel kesirleri veya kirleticiler kaldırılması tarafından daha fazla ayrılması için izlenmesi gerekir. Bu yöntemlerin tam ve dikkatli ve değiştirilebilir olmakla birlikte, sakıncaları maliyet, zaman tüketimi ve kesirler ve daha fazla arıtma ile yoğunluk gradient Santrifüjü ayrılması için bir ultracentrifuge ihtiyacını içerir. En yüksek hızlı santrifüjler bireysel müfettişler ve are sık sık paylaşılan, akademik kurumlar ekipman çekirdek için engelleyici bir maliyeti vardır. Böylece, ultracentrifuge durumu bu durumda engelleyici olur.
Bu ayırma protokol için hücre altı fraksiyonları deterjanlar çözücü kullanımı ve yüksek hızlı Santrifüjü olmadan yalıtım göstermektedir. Bu yöntem araştırmacılar plazma zarı, mitokondri ve kesirler arasında en az kirlenme bir ökaryotik hücrenin sitoplazmik bileşenleri izole etmek için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı gelişimi mitokondrial ayırmak için bir yetersizlik ve protein yerelleştirme necroptosis14sırasında çözümlenmesi için piyasada kitleri kullanarak membran örnekleri ortaya çıktı. Birincil hazır kitleri bireysel araştırmacılar, ihtiyaçlarına adapte için kendi yetersizlik onların başına maliyet örnek ve sınırlı sayıda örnekleri işlenmesi mümkün sınırlamalardır. Burada sunulan Yöntem pahalı reaktifler kullanılmadan ve pahalı ekipman için zor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İş NIH-1R15HL135675-01 Timothy J. LaRocca tarafından desteklenmiştir
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Referências
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).
