Summary
本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌种群中发生的表型多样性提供了资源, 以应对感染过程中的组织环境。
Abstract
细菌毒力基因通常在转录水平上受到多种因素的调节, 这些因素对不同的环境信号做出反应。一些因素直接作用于毒力基因;其他人则通过调整下游调节器的表达或影响调节器活动的信号的积累来控制其发病机制。虽然在体外生长过程中对调节进行了广泛的研究, 但对感染期间如何调整基因表达的了解相对较少。当特定的基因产品是治疗干预的候选产品时, 这样的信息很重要。转录方法, 如定量, 实时 rt-pcr 和 rna-seq 是在全球范围内检查基因表达的有力方法, 但也面临许多技术挑战, 包括细菌 rna 的低丰度相比, 和样本由 rnase 降解。使用荧光记者评估调节相对容易, 并且可以使用具有独特光谱特性的荧光蛋白进行多路复用。该方法允许对表现出复杂的三维结构和影响细菌调控网络的物理化学梯度的组织中的基因表达进行单细胞、时空分析。当数据对大宗人口进行平均时, 就会丢失此类信息。在此, 我们描述了一种定量基因表达的方法,在细菌病原体中的原位。该方法基于简单的组织处理和对报告蛋白荧光的直接观察。我们通过检查金黄色葡萄球菌的表达证明了该系统的效用, 其基因产物是免疫逃避和体内完全毒性所必需的。我们发现, 核酸-gfp在肾脏脓肿中表达强烈, 并揭示异质性基因表达的部分原因是明显的空间调节的酶启动子活性与免疫反应。该方法可应用于任何具有可操纵遗传系统和任何感染模型的细菌, 为临床前研究和药物开发提供有价值的信息。
Introduction
细菌通过不同表达适应和生存所需的基因来应对环境中不断变化的生理条件和营养状态的变化。例如, 机会性病原体在体型相对较低的地方对体表进行殖民, 而且往往是无害的。然而, 一旦细菌已经穿透物理和化学屏障, 它必须与宿主免疫细胞的反防御和限制营养的可用性1。例如, 金黄色葡萄球菌在大约三分之一的人口中进行了无症状的殖民, 但也是造成破坏性皮肤和软组织感染、骨髓炎、心内膜炎和菌血症 2的原因。金黄色葡萄球菌作为病原体的成功通常归功于其代谢灵活性, 以及一系列与表面相关和分泌的毒力因子, 使细菌能够逃离血液并在外周组织中复制3,4,5。由于葡萄球菌病引起的宿主死亡是进化的死胡同, 限制了对新宿主6的传播, 因此必须谨慎控制对毒力因子生产的承诺。
一个复杂的蛋白质调节网络和非编码 rna 响应各种环境刺激, 包括细胞密度、生长阶段、中性粒细胞相关因素和营养物质的供应, 以确保毒力基因在宿主组织内的精确时间和位置7、8、9、10、11、12、13.例如, SaeR/S 双组分系统 (tcs) 通过传感器激酶 (saes) 和响应调节器 (saer)14调节几个毒力因子的表达。sais 是在保守的组氨酸残留物上自动磷酸化的, 以响应宿主信号 (例如,人类中性粒细胞肽 (hnps), 钙儿热锡) 8,15,16。然后将磷基转移到 sael 上的天冬氨酸残渣中, 将其激活为 dna 结合蛋白 (saer ~ p)17。SaeR/S tcs 调节20多个基因, 这些基因有助于其发病机制, 包括纤维连接蛋白结合蛋白 (FnBPs)、白细胞介素和凝血酶14、18、19、20.目标可分为高亲和力和低亲和力基因靶标, 当暴露在线索21下, 随着 saer ~ p 水平的升高, 很可能会诱发高亲和力和低亲和力基因靶标。SaeR/S 活性由基因表达的其他调节剂控制, 如 agr 仲裁传感系统、毒素蛋白抑制剂 (rot) 和替代西格玛因子 b (sigma)22、23、24.
nuc是金黄色葡萄球菌中的一种与 sae 依赖的毒力基因, 并编码了热尿 (nk), 这对于从顺性疾病和细胞t (net) 中的逃逸和传播是必不可少的。感染过程25,26。在支链氨基酸和 gtp27存在的情况下, cody也会强烈地抑制血指的表达, 而葡萄球菌辅助调节剂蛋白 sara28,29 直接抑制着共色的表达., 其活性受氧气 (氧化还原状态) 和 ph 值30的影响.鉴于在小鼠感染模型中, sae和cc突变体被衰减, 因此有兴趣开发抑制其相应活动的化学干预措施26、31。尽管如此, 没有关于他们在感染期间的监管的信息。
荧光记者已被用来监测和量化单个细胞水平上的基因表达。在此, 我们提出了一种量化s的方法。金黄色葡萄球菌在感染过程中的基因表达, 当与体外转录组分析和强大的成像技术, 如磁共振成像 (mri) 和磁共振波谱 (mrs), 可以揭示细菌如何生理在体内调节, 而营养物质在某些位位中的相对丰度。该方法可应用于任何具有可追踪遗传系统的细菌病原体。
基因组整合载体概述。
基因组整合载体 prb4 包含来自金黄色葡萄球菌 300 SAUSA300_0087 伪基因上游和下游区域的 500个碱基对, 以促进同源重组。prb4 来源于对温度敏感的 pmad 载体主干, 其中含有红霉素耐药盒 (ermc) 和热稳定性β-半乳糖苷酶基因bgaB , 用于重组剂的蓝白筛选32。工程记者结构还包含一个氯霉素耐药标记 (猫) 选择后基因组整合和质粒消除, 以及 ecri 和 smai 网站融合监管区域感兴趣的超级文件夹绿色荧光蛋白 (sgfp) (图 1)。人们知道核糖体结合位点 (rbs) 的选择会影响记者的活动, 往往需要经验优化33。因此, 不提供苏格兰皇家银行。在这里, 本地核糖体结合位点被用来提供更自然的基因表达模式, 但其他位点可能会被使用。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了乔治敦大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 荧光记者应变的产生
- 用 ecori 和 smai 限制性酶依次消化基因组整合性 rb4 载体。按照制造商的协议, 在25°c 下使用1μg 的 prb4 建立一个隔夜消化, 然后在37°c 下通过在反应混合物中添加 ecori 进行1h 的第二次消化。在65°c 孵育 20分钟, 使酶失活。
- pcr 扩增了基因组 dna 感兴趣的调控区域 (在这种情况下, 包含热松糖启动子区域的约 350个碱基对 dna 片段), 包含了一个 5 ' ecri 限制位点和一个 3 ' smai 限制位点。smai 识别序列必须在具有平移起始密码子的框架内。在这项研究中, pcr 是根据制造商的建议使用高保真 dna 聚合酶进行的, 具有正向引物 oRB015 (5 '-atcattcattcattctaatttaatatatatatatatatatatac-3 ') 和反向引物 orb016 (5 '-gggcatactaactcttttttttagt3-3 ')。退火温度为53°c。按照制造商的说明, 使用 pcr 清理工具包纯化生成的片段。
- 按照步骤1.1 中的规定, 用 ecori 和 smai 消化产生的 pRB4 产物, 并按照制造商的建议, 使用 t4 dna 连接酶将被消化的 dna 片段连接到同样的 prb4 位点, 以生成整合结构。将结扎混合物引入大肠杆菌, 并确定构建顺序。
- 电孔构造成金黄色葡萄球菌菌株 rn4220 如前所述 34。简单地说, 使用1μg 质粒与70μl 的电主管细胞 (100ω, 25μf 和 2.3 kv) 在 b2 肉汤 (1% [w/v] 酪蛋白水解物, 2.5% [w/v] 酵母提取物, 2.5% [w/v] 氯化钠,0.1% [w/v] k 2 po 4, 0.5% [w/v] 葡萄糖)。选择在允许的温度 (30°c) 下,以红霉素 (5μg ml-1) 和 5-溴-4-3-二甲醇-β-d-半乳糖苷 (x-gal) 为补充, 对红霉素耐药性 (em r); 80 微克 ml-1).由于等离子体编码β-半乳糖苷酶活性, 由此产生的转化物为蓝色。
请注意:由于强的限制性修改屏障 35, 将 dna 转移到临床分离株是极其困难的。因此,金黄色葡萄球菌rn4220 被用作融合结构的中间接受者, 因为它是限制缺陷和高度可转换性的。 - 在允许的温度下, 用电穿孔或噬菌体介导的转导36将质粒转移到金黄色葡萄球菌300株。总之, 利用含有 5mm ccl 2 的 tsa 板在30°c 下过夜在供体菌株上繁殖 11噬菌体颗粒, 然后通过0.45 微米醋酸纤维素注射器过滤进行灭菌.利用裂解液将金黄色葡萄球菌株 lac 转化为 emr.
请注意:lac 是一种广泛使用的临床分离物, 以前通过 tsb 培养基中的串行通道对 em 敏感, 以治愈赋予 em37, 38的原生质粒 pusa03 菌株。 - 如前面所述, 将该构造由两个连续的同源重组事件整合到染色体中。重组剂在 tsa 板材上具有耐氯霉素 (mL), 含有 5μg ml-1 的氯霉素,红霉素易感性 (erm s), 不再为蓝色.
注: 在可能的情况下, 通过噬菌体介导的转导将标记的融合重新引入 usa300, 以避免与体外菌株39和温度变化相关的突变的积累。
2. 动物感染: 接种、全身感染和组织加工的制备
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细菌接种的制备
- 从冷冻甘油库存中分离血琼脂板的有兴趣的金黄色葡萄球菌菌株。在37°c 下培养 16-24小时, 根据溶血性红细胞 (rbc) 的能力, 确认溶血性表型, 并形成透明的区域。
- 通过在无菌玻璃管中将每个菌株的单菌落接种到4毫升的色粒豆汤 (tsb), 开始隔夜培养。在37°c 下旋转管16-24 小时, 在管辊设置在大约70°角和70次旋转每分钟 [rpm]。
- 使用分光光度计测量从步骤2.1.2 的培养物的光学密度为600纳米 (od600)。使用无菌介质作为光学参考 (空白)。将这些细胞稀释到 od 600, 在25毫升的无菌色氨酸大豆肉 (tsb) 中分别为 125 ml delong 烧瓶 (5:1 烧瓶与体积比), 并在水浴中孵育培养物 (以便适当地将热量传递到培养物) 中孵育培养物, 在 280 rpm 下晃动, 设置为37°c。
注: 接种疫苗的生长可以通过各种方式进行;提出了一种将细胞生长到指数相的方法。无论如何, 重要的是要持续使用相同的方法来准备细胞进行接种。 - 在 od600 ~ 1, 将细胞重新稀释到新鲜培养基中, 使其进入起始 od600 0.05, 以确保细胞达到指数相, 并确保在隔夜培养过程中积累的因素降低到指数级。
- 在指数相 (od600 ~ 0.6–0.8) 中通过在室温下以 3 , 000 x克离心10分钟来采集细胞。
- 用不育量1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs; ph 7.4) 清洗两次颗粒。
- 将 1x pbs 中的细胞 (ph 7.4) 悬浮到 1 x10 8个菌落形成单元 (cfu) ml-1的浓度上, 或根据所需的实验进行适当的。
注:对于每个感兴趣的菌株, 确定 od600和 cfu ml-1之间的关系非常重要, 因为细胞大小和形状的应变相关的改变会影响光散射特性, 并最终影响感染剂量。
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动物的制备与细菌感染
- 在纯化饮食中对小鼠进行7天的纯化。该饮食的配方是为了提供足够的营养, 同时减少组织自动荧光与食用植物为基础的成分使用的标准小鼠 chow40.
请注意:女性 c57bl6 小鼠 (6-8 大) 在这里使用, 但小鼠的毒株和性别将取决于研究。 - 感染前, 用温水扩张小鼠尾静脉。
- 通过尾静脉注射100μl 的细菌接种来感染动物, 从而产生全身感染。如果进行流式细胞术, 请保存初始接种物的一个部分 (参见第4节)。
- 每天监测动物, 并评估他们的健康状况使用监测系统审查和批准自己的机构动物护理和使用委员会。
- 允许感染在所需的持续时间内进行。在这里, 实验在感染后3天终止。
请注意:在这种情况下, 脓肿由葡萄球菌脓肿群落组成, 由纤维蛋白沉积包围, 并被免疫细胞的同心层包围5,41。
- 在纯化饮食中对小鼠进行7天的纯化。该饮食的配方是为了提供足够的营养, 同时减少组织自动荧光与食用植物为基础的成分使用的标准小鼠 chow40.
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收集器官和组织处理
- 以二氧化碳吸入和宫颈脱位为辅助方法, 对动物进行安乐死和尸检。
- 采集肾脏 (右) 和其他重要器官 (心脏、肝脏、肺、脾脏), 并转移到含有 10% [v/v] 缓冲福尔沙林的15毫升聚丙烯管中。继续这些机构在下面2.3.4。
- 将左肾脏转移到不育的2毫升抗冲击管, 其中含有 ~ 500μl 的2毫米二氧化硅珠和1毫升不育的 1x pbs (ph 7.4)。继续这个机构执行4.2 步。
- 允许2.3.2 的器官在室温下固定, 轻轻晃动或旋转至少 2 4小时, 但不超过 4 8小时。
- 将器官嵌入透明组织冷冻介质中, 并将组织储存在-80°c。
- 使用低温恒温器, 将组织切片成厚度为10μm 的切片。
- 在预先清洁的带电玻璃滑梯上擦干部分, 在黑暗中使用 4 ', 6-二胺-2-苯二酚 (dapi) 染色的硬安装介质, 并涂抹覆盖滑块。在室温下进行夜间固化, 并转移到4°c 进行长期储存。
3. 激光扫描共聚焦显微镜与图像处理
- 使用适合正在使用的荧光记者的激光检查已安装的幻灯片以定位病变。在这种情况下, 使用绿色 (gfp)、红色 (tdtomato) 和蓝色 (dapi) 荧光信号。
- 使用适当的目标获取图像以可视化单个单元格 (例如, 通常使用20x 或40x 目标)。
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测量共聚焦图像中的荧光强度。
- 打开图像 j 中的共聚焦图像, 并调整亮度对比度, 以正确显示病变的荧光信号。
- 定义感兴趣的区域, 并通过使用阈值选项, 根据需要设置下荧光和上位荧光限制。
- 通过选择"面积" →平均值灰度值→质心→在图像 j 中的 "分析" 选项卡下限制阈值来定义质心。
- 提取有质心荧光强度值或测量 gfp 和 tdTomato 给定单位面积 (平均荧光强度、mfi) 中的平均荧光强度。在这里, 使用了 1μm2的区域。
请注意:当已知样本的标识时, 盲目的第二分析可最大限度地减少偏差。 - 为每次比较绘制数据并执行适当的统计分析。
4. 流式细胞仪分析
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(可选)确定接种的融合活动在传染的天 (从部分 2.2.3)
- 在899μl 的1x 无菌 pbs (ph 7.4) 中, 每个接种剂加入 100μl, 膜蠕动核酸染色增加 1μl (见材料表)。作为一种对照, 一定要包括一个样本缺乏核酸染色。
- 对所有样品进行流式细胞仪检查。
请注意:对于第一个实验, 它是有用的, 包括一个矢量只控制的融合兴趣, 以确定正确的电压使用。正样本和负样本的明确分离对于数据分析至关重要, 这表明记者远远高于背景信号。 - 要识别细菌数量, 请使用核酸染色 (y 轴) 和向前散射 (x 轴) 绘制事件图。
- 根据正向散射 (金黄色葡萄球菌在0.5 至2.0 微米之间), 在核酸染色呈阳性和细菌正确大小的事件周围绘制一个夹杂物门.
请注意:在识别此群体时要严格, 因为包含明显在这些参数范围内的事件至关重要。确保此门排除其他条件下负控件的所有事件。在这项研究中, 大约70% 的细胞群在分析中满足了这些要求。
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牺牲后组织样本分析:
- 对动物进行安乐死, 收获左肾 (见步骤 2.3), 并转移到含有1毫升的1x 无菌 pbs (ph 7.4) 和250μl 的2毫米硼硅酸盐珠的珠殴打管中。
- 破坏组织以释放细菌细胞。对于肾脏, 使用均质机破坏细胞。在这里, 三个 30 s 爆发在6800转/分和1分钟冷却时间在湿冰周期之间使用, 以尽量减少加热样品。
- 将较大的组织碎片颗粒, 在 250 x g的温度下, 在冷却至4°c 的桌面微型离心机中离心3分钟。
请注意:通常情况下, 有一个细胞颗粒在底部的管和一层漂浮的碎片在顶部。中间水层包含细菌细胞。 - 将10μl 从水层转移到含有1μl 核酸染色的 1.5 ml 微离心管中, 在989μl 的 pbs (总体积为 1 ml) 中。
- 使用与初始接种相同的数据采集参数和浇注进行流式细胞术。
请注意:细菌细胞计数将很低, 因为样本主要含有组织碎片。如果细胞在将数据加载到应用程序中时是核酸染色阳性和大小门, 也可以使用 "活门" 选项。这还将有助于分析更多的目标事件并减少文件大小。每个样本统计近100万个事件, 但根据感染的严重程度和所分析的组织大小, 可能需要进行更多的事件计数。 - 数据分析: 使用4.1.4 节确定的夹杂门, 确定给定样品中每个荧光体的平均荧光强度 (mfi)。将流分析软件中的示例规范化为事件计数。在分析中, 10, 000个计数通常就足够了。
请注意:这是不常见的样本, 其中包含的事件少于这个数量, 因为这取决于脓肿的形成和感染的严重程度。使用这种方法, 500-40, 000个事件通常在受感染的组织中发现。
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Representative Results
我们开发了一种从 pmad32中提取的质粒, 它可以通过双交叉同源重组将任何记者融合结构传递到染色体中 (图 1)。这种结构允许对支持在背景上生产 gfp 蛋白和荧光信号的任何监管区域进行定量分析。质粒赋予安培耐药 (apr),用于大肠杆菌的维持和繁殖, 并赋予金黄色葡萄球菌红霉素耐药性 (emr) .该结构还具有耐氯霉素 (cm r), 从而可以方便地转移各种突变株之间的综合报告融合, 以便在金黄色葡萄球菌中进行复杂的遗传分析。
作为原理的证明, 我们将其调控区融合到gfp.得共选择了, 因为它的基因产物是完全毒力所必需的, 并且是限制金黄色葡萄球菌引起的脓肿42的巨噬细胞所必需的, 43岁如协议第1.4-1.6 步所述, 该结构被集成到染色体中。然后将集成融合转移到 ah3926, 其中包含一个 psarap1-tttoto融合。sara p1 启动子先前已被证明是本构活跃的44 , 因此, 标签所有细胞。
我们首先证实了记者的融合在色氨酸大豆肉汤 (tsb; 丰富的复合培养基) 的体外晃动瓶生长过程中是活跃的, 荧光水平高于细胞自动荧光背景 (图 2)。为了确定荧光记者在体内的行为, 采用了改进的肾脓肿模型5。女性 c57bl6 小鼠组接受了 1x107 cfu的静脉注射挑战, 每个金黄色葡萄球菌lac 细胞缺乏记者融合或 lac 细胞, 同时携带了 n发性 gfp 和 sarap1-ttous融合。动物在感染三天后被献祭。然后, 采集的器官固定在 10% [v/v] 缓冲福尔马林, 冷冻切片, 并在 dapi 染色后进行成像, 如步骤2和3所述 (图 3a, b)。利用图像 j 对图像进行了分析, 并对肾脏病变的单位面积荧光进行了测量。如图 3c 所示,携带核聚变的细胞中的 nuc-gfp融合荧光平均比不携带记者融合的细胞高近 9倍;后一个信号构成检测的极限 (自动荧光) (比较 nuc-sgfp到 lac)。同样,p sarap1-t1/1-tdcpe 融合荧光比无记者对照高 ~ 6倍 (图3e, 比较sarap1-tdt与 lac)。如第4步所述, 使用流式细胞术和流式细胞术, 证实了报告活动的模式, 但荧光的褶皱差异较低 (图 3d, f)。
有趣的是, 携带荧光记者融合的细胞形成的病变的荧光数据似乎比缺乏记者的细胞具有更高的变异性。我们想知道观察到的荧光测量的变化是否由于记者的异质表达 (即生物起源)。事实上, 在 ~ 100μm 的距离内, 发现一些病变表达了一个或两个记者 (图 4)。重要的是 , 研究葡萄球菌脓肿群落中单细胞分辨率的记者活动揭示了在具有强 dapi 染色的脓肿中 , 表达的空间调节 , 这可能与中性粒细胞外陷阱的形成和释放 (图 5a-c)45。例如, 我们测量到, 与外围的外相外, sac 内部核心的核酸-sgfp融合荧光要高得多 (图 5b, e)。在同一脓肿中, sarap1-tttoto融合荧光的模式出现了反转 (图 5d)。然而, 使用相同数量的动物, 这种模式在统计上并不显著 (图 5f)。
图 1:基因组整合报告质粒 grb4 的原理图表示.质粒 prb4 是 pmad 的衍生物, 其在金黄色葡萄球菌(ori pRB4ts) 中具有温度敏感的复制来源。有三种耐药标志物: (i ) bla, 使大肠杆菌中的氨匹西林产生耐药性;(ii) ermc, 引起红霉素耐药;和 (iii)猫, 赋予耐氯霉素在金黄色葡萄球菌。记者结构由大约 500 bp 分别从伪基因SAUSA300_0087的上游和下游序列 (参考基因组: fpr3757) 的两侧, 用于双交叉同源重组和基因组整合。绿色荧光蛋白基因;cs, 克隆位点;tt, 强双向转录终止器。图不是缩放的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 我。恩格拉德nuc-sgfp(2)sarap1-tttoto记者在体外生长过程中表达. 金黄色葡萄球菌lac 细胞 (野生型 [wt]), 有和没有 (a)nuc-sgfp 或 (b) sarap1-ttoto记者) 在 tsb 中生长成指数级, 并被再稀释到同一介质中. 在指示的光学密度值下测量了光学密度 (od) 和荧光。背景减去荧光强度值 (激励/发射: sgfp, 48535nm; tdTomato [tdt], 535/590 nm) 除以光学密度值, 生成相对荧光单位。数据是两个独立实验的方法。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 荧光记者在肾脏组织中可见.13例 c57bl6 小鼠的组使用带有nc-sgfp和sarap1-tttoto (tdt)的 lac 细胞或 lac 细胞进行静脉注射挑战, 并允许感染持续三天。按照协议第2步和第3步的描述, 对老鼠进行了安乐死, 对器官进行了处理。代表性肾脏切片显示多个病变和相关荧光 (a) nuc-sgp和 (b) sarap1-tttoto.刻度柱 = 250 微米 (10倍目标)。用步骤3.3 所述的图像分析测量了与肾脏病变相关的单位面积相对荧光单位 (rfu[μm 2]-1),并绘制了 (c)核酸-sgfp和 (e)的图sarap1-tttoto;每个点表示一个病变, 条形表示中值;每只小鼠分析3-5 个病变。流式细胞仪分析 (d) 核酸酶gfp和 (f) sarap1-ttoto融合荧光从感染肾均质分离的细菌群体在感染后三天。平均荧光强度 (mfi) 由实心条表示, 每个点是一个肾。lac, 无报告人野生类型菌株。统计数据: 曼恩-惠特尼测试;p < 0.05。这些数据代表了两个独立的实验。荧光通道的激发波长如下: dapi, 405 nm;gfp, 488 纳米;番茄, 561 纳米。发射荧光数据的波长范围如下: dapi, 419-481 纳米;sgfp, 505-551 nm;番茄, 575-630 纳米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 脓肿在肾脏组织中表现出不同的记者表达.13例 c57bl6 小鼠的组接受 1 x 10 7金黄色葡萄球菌细胞 cfu 的检测。动物在感染三天后被安乐死。如协议第2步所述, 为荧光显微镜 (40x 目标) 采集、固定和切片肾脏。显示的是三个病变接近与可变水平的 (a) nuc-sgfp和 (b) sarap1-tttoto 荧光。(c) dapi 染色显示葡萄球菌和宿主细胞中的核酸。绿色和红色通道合并在 (d) 中。其他章节也看到了类似的结果。这些图像是使用40x 的目标获得的;刻度杆 = 25μm。荧光通道的激发波长如下: dapi, 405 nm;gfp, 488 纳米;番茄, 561 纳米。发射荧光数据的波长范围如下: dapi, 419-481 纳米;sgfp, 505-551 nm;番茄, 575-630 纳米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:nuc-sgfp在葡萄球菌脓肿微环境中进行空间调节.共聚焦激光扫描显微镜 (clsm) 图像的葡萄球菌脓肿 (sac) 病变产生的金黄色葡萄球菌株 lac 携带nuc-sgfp和sarap1-ttous记者融合. 显示的是 (a)核酸 (蓝色) 和 (d) 的核酸的 (a) 合并通道, 用于核酸和sarap1-t番茄、(b) nuc-sgfp 荧光 (绿色)、(c) dapi 染色 番茄荧光 (红色)。星号表示核心 (质心) 中的细胞, 箭头表示周围的细胞。显示了 sac核心和外围 细胞的荧光强度。荧光通道的激发波长如下: dapi, 405 nm;gfp, 488 纳米;番茄, 561 纳米。发射荧光数据的波长范围如下: dapi, 419-481 纳米;sgfp, 505-551 nm;番茄, 575-630 纳米。这些数据来自8个肾脏 (每只老鼠 1个), 每个肾脏都有1-2 个病变的图像。条形图表示中间值。虚线, 检测的限制。统计: 数据的正常分布, 学生的 t 测试 (未配对), * * ** p < 0.05。(刻度条 = 20μm; 适用于所有图像。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
由于获得抗生素耐药性决定因素46, 细菌传染病是全世界日益严重的健康问题。由于适应宿主环境对于感染过程中的生长和生存至关重要, 因此针对提高病原体适应性的基因表达程序的策略可能会被证明是有用的治疗方法。其中一个程序是由 SaeR/S s 双组分系统 (tcs) 控制的一组基因, 以前所显示的在免疫逃避中起着至关重要的作用47。SaeR/S 是由多种因素引起的, 最显著的是与中性粒细胞8、20 有关的因素。在感染过程中,金黄色葡萄球菌引起强烈的炎症反应, 在这种反应中, 中性粒细胞和其他吞噬细胞被招募到感染部位 2。液化坏死和纤维蛋白沉积接踵而至, 形成脓肿, 以防止进一步的组织损伤48。在这些免疫特权位点内,金黄色葡萄球菌细胞使用一些依赖于 sae 的基因产物来重新编程脓肿, 以促进细菌繁殖 5,48。一个与 sae 相关的基因, nuc,核酸酶和代谢的 nt 产生 2 '-脱氧腺苷杀死巨噬细胞43。因此, 细胞是一种重要的分泌酶, 对完全毒力42至关重要, 并在体内表达 (图 3,图 4,和图 5)。
虽然金黄色葡萄球菌的毒力因子已被广泛研究, 细菌如何生长在宿主是一个研究不足的领域, 以及了解其生理如何调节感染。在这里, 我们描述了一种方法, 探索细菌基因的表达和行为在单个细胞水平上使用一个修改的综合载体, 以减轻在没有选择的情况下对质粒丢失的关注。我们的方法允许直接可视化的基因表达在脓肿, 而不必渗透细胞壁, 而无需抗体和标签。我们在急性全身感染模型中检测到急性全身感染模型中由野型细胞在感染三天后形成的肾脓肿 sac 中的核酸-sgfp 融合和sarap1-ttoto 融合的强烈表达。然而, 实验设计可以修改, 以回答有关其他部位基因表达的问题。事实上, 由于 c57bl6 小鼠无法从其组织中清除金黄色葡萄球菌, 细菌侵入不同的解剖部位, 包括骨骼系统 (骨骼和关节) 和大脑、心脏、脾脏和肝脏, 所有这些都有不同的生理特征和营养特性5,49。因此, 可以通过使用金黄色葡萄球菌来探索宿主组织的性质。需要注意的是, 众所周知, 某些寄主的生态位在本质上是低氧的, 或者表现出强烈的氧梯度50。荧光蛋白的活性需要分子氧, 有些比其他蛋白质对氧分压更敏感 51.虽然我们在脓肿深处看到荧光信号, 但其大小可能被低估了。使用用于艰难梭菌的可优化的荧光蛋白可用于缓解这一问题52。第二点需要注意的是, 本研究中使用的记者菌株产生的荧光蛋白 (sgfp 和 tdTomato) 是稳定的。因此, 荧光数据反映的是实验过程中的积累, 而不是最近的反应。生成含有不稳定的 sgfp 或 tdtomato 基因的构造将大大提高系统在动态实验中的效用。
本文所描述的报告系统为定量研究体外和体内的基因调控提供了有力的工具。由于记者在染色体上保持在单个副本中, 因此该系统非常适合强烈表达的基因 (即具有较高的启动子活性)。生物合成基因或其他低表达基因可能不可见, 因为荧光表达水平可能低于检测或背景自动荧光的极限。据了解, 核糖体结合位点 (rbs) 影响记者融合的活动 33.解决这一问题的一个潜在办法是使用更强大的 rbs, 如翻译起始区域 (tir)53 , 或将感兴趣的促进剂的串联拷贝集成到染色体中。或者, 可以使用稳定的多拷贝质粒 54。
所述方法的一个局限性是, 与从组织中提取的 rna 中提取的 cdna 制剂不同, 可以同时审问相对较少的基因 (受到没有光谱重叠的现有荧光通道的限制)。然而, 所获得的内容可能会提供更多的信息。qrt-pcr 和其他读数, 平均大人口无法捕捉种群异质性的感染部位。事实上, 我们观察到了近距离脓肿病变之间的 n见面-sgfp 和sarap1-ttoto 表达水平的异质性 (图 4)。这与 cassat等人最近报告的情况类似。55目前, 这种异质性的起源尚不清楚。然而, 养分的可用性、养分获取系统的可变诱导或其他寄主因素可能解释了这一现象。此外, 宿主-病原体相互作用发生在具有复杂三维结构和不同细胞类型的器官或脓肿的微环境中。在这些结构中, 组织在 ph 值、渗透性、氧合和养分可用性方面可能会有很大差异, 这种现象被称为代谢分区 56,57。我们偶然发现, 一种空间调节模式出现在存在于脓肿中的野生细胞中 (图 5)。据我们所知, 这是在感染期间在革兰氏阳性病原体中首次观察到的。这里报告的空间规律与 davis等人获得的空间调节相似.在脾脏组织中含有革兰氏阴性病原体耶尔森结核58的微菌体。在这种情况下, 宿主产生的一氧化氮 (no *) 刺激了在离扩散 no * 的微群体外围细胞中产生一氧化氮二氧合酶 (hmp), 省去了内部细胞诱导hmp表达的需要。在葡萄球菌脓肿中, sac 的核心表现最强烈, 周围的血本最弱。由于脓肿被中性粒细胞的袖口所包围, 因此很容易推测中性粒细胞衍生的线索正在引导葡萄球菌的行为, 将细胞偏化为两个表观不同的群体, 让人联想到形态在更高的生命中, 在发展过程中对分化的调节59。这种模式的机械支撑是未知的, 是我们实验室紧张研究的课题。
我们相信我们的方法为研究感染过程中单个细胞基因表达的精细细节提供了有效的工具。该方法为观察并最终了解异质性的生理起源和组织中基因表达的空间模式提供了一个独特的机会。在制定新的治疗方式时, 必须考虑到这种异质性行为, 因为只有细胞亚群 (即表达基因的细胞) 可能是治疗的目标。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢亚历山大·霍斯威尔赠送的 psarap1-ttoto融合, 并感谢 karen creswell 对流式细胞术分析的帮助。我们还感谢阿丽萨·金就统计分析提出的建议。这项工作的部分资金来自国家卫生研究院探索者/发展研究奖 (赠款 AI123708) 和向工代机构提供的教职员工创业基金。资助者在研究设计、数据收集和解释方面没有任何作用, 也没有决定将作品提交出版。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
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