Summary
Denna studie beskriver processen för gavaging exakta mängder probiotika till nyfödda möss. Experimental set-up var optimerad för att inkludera men är inte begränsat till probiotiska dosering, metoder för administration och kvantifiering av bakterier i tarmen.
Abstract
Adult musmodeller har använts att förstå mekanismen bakom sjukdomsutvecklingen hos människor. Tillämpligheten av studier som gjorts i vuxen musmodeller till neonatala sjukdomar är begränsad. För att bättre förstå sjukdomsprogression, värd svaren och långsiktiga effekterna av interventioner hos nyfödda, är en neonatal musmodell sannolikt en bättre passform. Glesa användningen av neonatal musmodeller kan delvis hänföras till de tekniska svårigheterna av att arbeta med dessa små djur. En neonatal musmodell utvecklades att avgöra effekterna av probiotiska administration tidigt i livet och särskilt bedöma möjligheten att upprätta kolonisationen i tarmkanalen nyfödd mus. Specifikt, för att bedöma probiotiska kolonisationen i neonatal musen, levererades Lactobacillus plantarum (LP) direkt i neonatal mus mag-tarmkanalen. Därför gavs LP till möss genom att mata genom intra-esofagus (IE) sondmatning. En mycket reproducerbar metod utvecklades för att standardisera processen för IE sondmatning som gör en korrekt administration av probiotiska doser samtidigt minimera trauma, en aspekt som är särskilt viktigt med tanke på bräckligheten i nyfödda möss. Begränsningar av denna process inkluderar möjligheter av matstrupen irritation eller skador och aspiration om gavaged felaktigt. Detta synsätt utgör en förbättring jämfört med nuvarande praxis eftersom IE sondmatning i distala matstrupen minskar risken för aspiration. Efter sondmatning, colonization profilen för probiotiska spårades med kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) av extraherade intestinal DNA med LP specifika primers. Annan kull inställningar och bur tekniker användes att bedöma potentialen för colonization-spread. Protokollet Detaljer krångligheter av IE neonatal mus sondmatning och efterföljande kolonisering kvantifiering med LP.
Introduction
Hos spädbarn, har tidig probiotiska exponering associerats med immunmodulerande effekter leder till minskad förekomst av sjukdomar som nekrotiserande enterokolit, atopisk dermatit och sepsis1,2,3, 4 , 5. men mekanismen bakom detta immunmodulerande svar är svårt för att utforska ges begränsningen till provtagning i nyfödda mänskliga försök (dvs. sekventiell blod dragningar och biopsier). Neonatal musmodeller kan hjälpa till att studera verkningsmekanismen inblandade i neonatal immunreglering associerade med probiotiska användning och ändringar i den intestinala bakterieflora. Tyvärr, de flesta musmodeller för probiotika har till stor del fokuserat på vuxna möss; effekten av probiotika är dock sannolikt att vara högsta tidigt i livet, vilket tyder på modeller som är specifika för denna åldersgrupp kommer att vara användbar3,6. Dessutom är neonatal musmodeller bättre lämpade att studera sjukdomar och ingripanden avsedda för tillämpning i tidiga liv mänskliga spädbarn som de förväntas att närmare efterlikna en utveckla immun och mikrobiella system7,8 ,9,10. Syftet var att undersöka omfattningen och mönster för probiotiska kolonisering av neonatala möss med fokus på den mekanistiska interaktionen mellan värden och dess mikrobiomet. Lämpliga beskrivningar av nyfödda modeller hittades inte i litteraturen, och således ett behov av utveckling av robusta och standardiserad metod var riktat.
Etablerade metoder för oral administrering av olika föreningar till nyfödda möss inkluderar mödra överföring av önskad föreningar genom mjölk genom att behandla vattenkällan för gravida dammar11 eller använda utfodring nålar för att underlätta administrering av önskad föreningar i orofarynx12. Dessa metoder är användbara för experiment som inte har krav på exakt dosering och där behandlingen är lätt intas av mottagarens musen. Probiotika är ofta administreras tillsammans med en prebiotiska såsom galactooligosaccharide och Fruktooligosackarid (FOS) som fungerar som en källa till näring för probiotiska bakterier; dessa additiva föreningar gör lösningen trögflytande och utmanande att administrera via ovan nämnda metoder. Utforma en metod för att administrera exakta mängder probiotika och prebiotika att nyfödda möss början så tidigt som den första dagen i livet (DOL) var nödvändigt. Håller på att utveckla den sondmatning tekniken, möjligheten till colonization-spread (som observerats i andra probiotiska studier mellan behandling och kontroll vapen13,14,15,16) testades och bedömdes det relativa överflödet av koloniserade Lactobacillus plantarum (LP) i tarmen av pups med olika sondmatning scheman. Probiotiska preparatet används i experimenten bestod av 109 kolonibildande enheter (CFU) per sondmatning av LP (ATCC-202195 stam), blandat med FOS (prebiotika) och maltodextrin (hjälpämne) som beskrivs i senaste mänskliga prov3. Probiotiska leveransen var fulländad använder IE sondmatning och processen är detaljerad i protokollet nedan. Colonization profilen för probiotiska utvärderades med hjälp realtid amplifiering av DNA extraheras från hela tarmen använder LP specifika primers.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes som hänför sig till de riktlinjer som fastställts av stöd Personalen på djur vård anläggning vid University of British Columbia och alla förfaranden godkändes av utskottet UBC djur för hand.
1. kvantifiering av probiotika som administreras
Obs: Detta steg rekommenderas att fastställa det exakta beloppet av probiotiska CFU som kan administreras i en dos. Mängden probiotika och fordonet (FOS och maltodextrin) fastställa mättnad villkoren för lösningen. Från erfarenhet, kan inte mer än 30 µL (~ 20 mL / kg) av vätska ges till möss på DOL 2 som någon större volym ökar risken för aspiration.
- Förbereda sex 1,5 mL mikrocentrifugrör seriespädningar med varje tub som innehåller 180 µL sterilt 5% dextros koksaltlösning.
- Väger en 0,2 g alikvot av en probiotisk-prebiotiska blandning och lös den i 1 mL 5% glukoslösning koksaltlösning i ett sterilt sätt.
- Virvel för 30 sekunder och pipett för att bryta klumpar. Upprepa tills inga synliga klumpar observeras.
Obs: Maltodextrin gör lösningen trögflytande och bidra till lösning mättnad. - Utföra en seriell utspädning med rören som bereddes i steg 1,1. Vortex att blanda.
- Platta 40 µL av varje utspädning på en märkt kvadrant av MRS agarplattan. Tallrik varje utspädning i två exemplar.
- Inkubera under anaeroba (eller namnet) villkoren vid 37 ° C för 48 h i en vakuum burk använder en gas-pack.
- Räkna varje platta inom intervallet 20-70 kolonier per kvadrant. Genomsnittliga plattan räknar med den samma utspädningen och beräkna tillbaka till önskade enheter.
2. beredning av probiotika och prebiotika för sondmatning
Obs: Korrekt upplösning av probiotika och prebiotika är nödvändiga för att säkerställa jämn insprutning av vätska genom utfodring nålen under sondmatning.
- Kombinera den erforderliga mängden av frystorkade probiotiska organism med de önska mängderna prebiotika och fordon i ett sterilt mikrocentrifug rör.
- Lägg till lämpliga mängder lösningsmedel (5% dextros koksaltlösning) att upplösa probiotiska-prebiotiska blandningen.
Obs: Upplösning kapacitet är begränsad av den prebiotiska och fordon som används. Från erfarenhet nådde synbiotic kombinationen (med FOS och maltodextrin) mättnad på ca 0,3 g/mL medan upplösning i en 2 mL mikrocentrifug rör med 1 mL vätska. - Vortex att blanda tills alla fasta ämnen löses. Använd en Pipettera bryta upp globuler av fasta partiklar i vätskan genom pipettering upp och ner.
- Inkubera lösningen i ett vattenbad på 37 ° C i 20 min.
Obs: Detta steg kan hoppas över om den probiotiska-prebiotiska lösningen skapas från en levande kultur. - Plåt en fem-serien 10-faldig utspädning på MRS agarplattor innan sondmatning att exakt kvantifiera probiotiska administreras till pup. Detta steg kan hoppas över om antalet CFU korrekt inte behövs.
3. beredning av biosäkerhet skåp
- Använd en biosäkerhet skåp när du arbetar med probiotika för att underhålla aseptisk teknik. Ställa in buren med dammar och ungar på en värme filt (satt till cirka 38 ° C) på en halvan av filten. Placera en ren, Tom djurs bur på den andra halvan av värme filten.
- Plats en desinficeras eller steril, absorberande pad på värme filten tenderar att musen under sondmatning.
- Samla in häckande material för valparna från toppen av befintliga, dam-skapade boet och skapa en ny konisk häckande kopp med handskar på händerna, desinficeras med 70% etanol och torkas. Placera denna nya boet i ren, Tom innehav buren. Detta underlättar överföringen av doften av boet till behandskade händer och därmed minimerar införandet av andra dofter på pup samtidigt hantera dem för förfarandet för att minska risken för cannibalization.
- Flytta pups i koniska boet håller buren och ta bort buren med dammen från skåpet. Detta minskar stressen för dammen genom att förhindra det från att höra valparna under förfarandet.
Obs: Om probiotiska är en känd kolonisatör i murina tarmarna, behandling villkoren måste vara avgränsade med burar eller ens olika biosäkerhet skåp för att undvika möjligheten till gränsöverskridande colonization.
4. Intra-esofagus sondmatning av neonatal mus
- Öppna spruta förpackningen för enkel åtkomst. Öppna förpackning av nålen i ett sterilt sätt och koppla den till huvudet av sprutan. Tvätta nålen med 70% etanol och autoklavera före ingreppet. Använda olika uppsättningar av nålar för behandling och kontrollgruppen för att undvika kontaminering.
- Dra lite mer än den önskade mängden probiotiska-dye lösning i sprutan. Håll sprutan uppåt. Sedan dra ytterligare och svep med fingret för att få bort bubblor och trycker på kolven att utvisa bubblor och den extra flytande volymen tills önskad volym uppnås. Detta säkerställer att det finns ingen luftspalt i nålen. För DOL 2-mus, får sondmatning volym inte överstiga 30 µL.
- Placera pup till sterila absorberande dynan ovanpå värmedyna. Använd den utfodring nålen (24 Gauge, 1 ”nål längd, 1,25 mm boll diameter) externt för att mäta längden på matstrupen genom att placera bollen av nålen strax nedanför den xiphoid processen (nedre delen av bröstbenet). Markera nålen i nivå med nosen att notera gränsen för införande av nålen (figur 1). Observera pup för hälsa tecken, som inkluderar regelbunden andning och rosa färgning av huden.
- Doppa spetsen på nålen i doppa lösningsmedlet (5% dextros koksaltlösning eller -mediet används för att upplösa probiotiska och pre biotiska) att smörja utvändiga ytor av utfodring nålen. Detta underlättar smidig inträde av nålen i matstrupen av musen.
- Lyft pup kragen eller genom att försiktigt hålla huvud och kropp mellan tummen och pekfingret. Säkerställa huvud, nacke och kropp hålls i en rak position. Håll inte pup kragen för längre än 60 s eftersom det är en risk för obstruktion av luftstrupen leder till kvävning. Säkerställa pup kan andas. Tecken på scruffing för hårt kan inkluderar oförmåga att andas, betydande kippar och tungan utsträckt ut munnen. Övervaka pup's färg och andning under hela förfarandet.
- Infoga glödlampan av nålen i mitten av munnen av pup i 45° vinkel mot planet i överkropp tills den når baksidan av halsen.
- Ändra försiktigt vinkeln på nålen genom att pivotera på glödlampan av nålen och flytta sprutan bort från den gavaging personen (mot den dorsala sidan av pup) tills den är parallell med planet av pup's ryggraden. Scruffing pup hjälper till att hålla nålen på plats i svalget och förhindrar även musen från skruva. Kontrollera bollen av nålen inte avancera eller utöva någon press mot baksidan av halsen under förändringens vinkel.
- Om musen försöker svälja nålen, låt det naturligt Skjut nedåt och arrestera rörelsen när märkningen på nålen ligger i linje med nosen. Sprutan och nålen är oftast tunga nog att glida ner due gravitation. Stöd vikten av nålen hela tiden så nålen glider lätt ner i matstrupen med ingen prispress från den person som utför sondmatning.
- Om nålen möter motstånd i svalget, återkalla sondmatning nålen något för att få bort bollen av nålen och åter vinkel nålen inuti munnen mot vänster musklick (hanterares höger) långsamt i små, steg om 1 mm. Nålen ska börja glida enkelt ner i matstrupen.
- Om nålen stannar innan markeringen på nålen når munnen, injicera inte lösningen.
- Förvara inte nålen isatt för mer än 20 s. Om detta inträffar, dra tillbaka nålen långsamt medan du håller sprutan parallellt med bålen och låt pup vila på hushållspapper för 30 s till 1 min. prova gavaging igen efter att smörja nålen med lösningsmedlet yttre yta.
Obs: Anestesi används inte för förfarandet som musens svar är nödvändigt att mäta framgången för sondmatning.
- När markeringen på utfodring nålen är ovanför nosen och i linje med spetsen på nosen, låt inte nålen flytta eller avancera någon vidare. Injicera långsamt önskad volym av vätska. Om vätskan är aspirerade eller observerade att bubbla genom näsan, sluta omedelbart att injektionen och dra långsamt in nålen.
- Placera pup upprätt på hushållspapper på värme pad till stöd i sin återhämtning. Noggrant övervaka för fortsatt andningsproblem eller ändra färgen på den pup vilket tyder på ambition. Avliva valparna som har aspirerade omedelbart.
- När sondmatning är klar, försiktigt dra tillbaka utfodring nålen i samma vinkel som den infogades. Placera pup på hushållspapper på den värmde värmedyna. Vänta 10 s för pup till återfå normal aktivitet och andningsmönster. En frisk rosa nyans ska visas över den pup's kropp och färgämnet bör endast vara synlig i magen facket. Flytta tillbaka till buren med andra valparna.
Obs: Gavaging blå karamellfärg är ett utmärkt sätt att öva det förfarande som beskrivs ovan. Om sondmatning lyckas kommer magen av musen att visas som en blå nyans. Om det blå färgämnet hittas utanför magen av pup (halsen, bröstet eller armhålan region) ska djuret vara humant avlivas (enligt djurvård regler), eftersom detta tyder på en bristning i matstrupen eller aspiration.
5. provtagning för intestional för kolonisering analys
- Under efterföljande övervakning eller gavaging, samla fekal mikrobiomet prover från valparna.
Obs: Pup ofta kissar och defecates när gavaged och denna tid kan användas som en möjlighet för att samla de fecal proverna för mikrobiomet analys. - För uppsägning av experiment, samla tarmarna från tolvfingertarmen till rektum efter avlivning av valparna. Fäst pup till en kirurgisk styrelse och desinfektera huden med 70% etanol. Skär bort huden i fyra kvadranter utan att skada peritoneal lagret med hjälp av verktyg steriliseras med 70% etanol och en varm pärla sterilisering vid 250 ° C.
- Använda en annan uppsättning sterila verktyg att skära bukhinnan i fyra kvadranter och flytta den bort från centrum på ett sätt som att de viscerala organ utsätts.
- Leta upp magen och Använd en klämma för att nypa nedan pyloric ringmuskeln och i slutet av ändtarmen. Kör längden på tarmen med hjälp av ett trubbigt verktyg eller pincett att effektivisera tarmen och befria det från bindväv och mesenterica vävnad. När hela längden av tarmen har befriats av bindväv, skär spänns ändar.
- Markera aluminiumfolie med orientering av tarmen, Linda på ett säkert sätt och frysa vid-80 ° C.
Obs: Förfarandet för DNA-extraktion kan utföras på denna punkt utan frysning. Det blå färgämnet sågs också att passera genom tarmen över 24 h och provtagning för kolonisering analys är bästa när tarmarna samlas minst 24 timmar efter den sista sondmatning. Signalerna kan förstärkas innan denna tidpunkt av icke-följs bakterier normalnivå passerar genom sondmatning blandningen.
6. DNA-extraktion från tarmar för kolonisering analys
Observera: Den DNA-extraktionen sker med hjälp av ett kommersiellt kit med optimera ändringar gjorts i protokollet för den tarmen DNA-extraktionen. Säkerställa värmeplattan är inställd på önskad temperatur och de lösningar som behöver förändringar eller före uppvärmningen är beredda på lämpligt sätt.
- Förbereda den enzymatisk Lysis buffert (ELB) enligt följande: göra en lösning med 20 mM Tris-Cl, 2 mM natrium EDTA och 1,2% Triton x-100. Justera pH till 8.0. Omedelbart innan du använder ELB, lägga till lysozym till en slutlig koncentration på 20 mg/mL.
- Pre väga garnet pärla rören på Analysvåg med locken tas bort.
Obs: Detta görs så att om den krävs vikten är överskrids, är det lättare att ta bort tarminnehållet. - Skär tarmarna i små segment med en steril engångs skalpell och scoop önskad segmenten till pre vägde garnet pärla rören.
Obs: Se till att ändra skalpeller mellan varje prov som DNA är allestädes närvarande och kan påverka PCR-resultat. - Tillsätt 1 mL av ELB med lysozym (från steg 6.1) till varje rör, placera på vortexa pärla drevkarlen och kör på högsta inställningen (14) i 5 minuter.
- När vävnaden är störd, överföra rören till 37° C vattenbad och inkubera i 30 minuter.
Obs: Detta steg är klar för att aktivera lysozym och inducerar nedbrytning av cellväggen peptidoglykan av grampositiva bakterier. - Förbereda tuber med 20 µL av proteinas K för varje prov med en koncentration på 600 mAU per mL.
- Centrifugera rören vid 400 x g i 10 minuter. Den lysate ska se klart med vissa vävnad rester ovanpå pärlorna.
- Över 180 µL av supernatanten (den övre fasen) till ett provrör innehållande proteinas K och Lägg sedan till 200 µL AL buffert röret. Virvel för 15 s att blanda.
- Placera rören på värmeblocket vid 56 ° C i 10 minuter.
- Tillsätt 200 µL av 100% etanol till röret och blanda genom vortexa för 15 s.
- Tillsätt cirka 600 µL av lysat till kolumnen spin (från kit).
- Centrifugera i 1 minut vid 8000 x g. Kassera flödet genom.
- Upprepa steg 6.12 tills alla den lysate har dragits genom kolonnen.
- Placera kolumnen i en ny samling tub. Tillsätt 500 µL av AW1 buffert och centrifugera vid 8000 x g i 1 minut.
- Kassera flödet genom. Tillsätt 500 µL av AW2 buffert och centrifugera vid 8000 x g i 3 min.
- Kassera flödet genom och centrifugera kolumnen i en tom samling röret vid 8000 x g i 3 min.
- Flytta kolumnen till DNA eluering tube. Tillsätt 60 µL av PCR-grade ultrarent vatten direkt på membranet och Inkubera under 2 minuter vid rumstemperatur.
- Använd det före värmde eluering vattnet vid 37 ° C för att eluera. Elueringen kan göras två gånger av med halva sista elutionsvolymen och upprepa steg 6.15 två gånger för att öka avkastningen.
- Centrifugera i 1 minut vid 8000 x g till eluera DNA.
- Mätning av koncentrationen av DNA elueras med metoden önskad kvantifiering. Den extraktion process avkastningen är i intervallet 10-40 ng/µL DNA.
- Lagra de eluerade DNA vid-20 ° C.
7. qPCR setup
- PCR-villkor
- Slå på maskinen och läsa in programmet i tabell 1 i en realtid qPCR maskin.
- Upprepa steg 3 till 5 i tabell 1 för 40 cykler och håll provet vid 4 ° C i slutet av reaktionen.
- PCR-experiment
- Använd grundfärg och temperatur finns i tabell 2. Använda koncentrationer och reaktion villkor finns i tabell 3. Ställa in varje reaktion i tre exemplar till kontrollen för processuella variation.
- Placera PCR-reaktion rör/plattan i qPCR-systemet och kör programmet laddas in i systemet från steg 7,1.
- Ta bort röret i slutet av körningen, placera den på 4 ° C och förbereda för gel lastning.
8. kvantifiering av LP kolonisering
- Förbereda qPCR mixar för 10 µL eller 20 µL reaktioner enligt tabell 3.
- LP genomisk DNA standardkurvan 107 till 101 kopior/μl
Obs: Eftersom 4 µL av varje utspädning kommer att vara klädd, 107 exemplar i 4 µL eller 2,5 x 106 exemplar per µL krävs i Start materiel. Använd samma princip för resten av kurvan.- Förbereda en spädning 1:4:107 exemplar per µL i 50 µL.
3.147 µL av LPDNA + 46.85 µL av dH2O = 2,5 x 106 exemplar per µL - Seriellt Späd 10-faldig: Tillsätt 5 µL till 45 µL dH2O för 1,25 x 105 kopior/μl.
- Tallrik 4 µL per utspädning per brunn.
- Förbereda en spädning 1:4:107 exemplar per µL i 50 µL.
- Visualisering av LP amplikoner
- Använd en 2% agarosgel för att nå en tydlig åtskillnad mellan den ~ 197 bp LP förstärkta fragmentet.
- Ladda 9 µL av varje PCR-produkten i gelen.
- Kör gelen i 30 minuter vid 120 V.
Representative Results
Unikitet med denna metod vilar i dess anpassning av tekniken med gavaging storlek och svaghet i en neonatal mus. Föregående avsnitt beskrivs de viktigaste stegen i utföra en lyckad sondmatning procedur på en DOL 2 mus. För att upprätta en bra kvantifiering skala, genererades en standardkurva med ren LP DNA med tre tekniska replikat (figur 2). Standardkurvan som ett dynamiskt omfång av upptäckt av LP DNA använder primers. Det dynamiska omfånget var mellan 7 och 28 cykler där en rad 101 107 kopior av LP DNA detekterades. Stadig slutta av standardkurvan representerade den effektivitet och skalbarhet i reaktionen.
Förfarandet för IE sondmatning har använts i vuxna möss med relativ lätthet. Men övre mag-tarmkanalen på en neonatal mus är bräcklig och krävs kalibrerad rörelser av sondmatning nål under förfarandet. Upprepade gavages kan öka chanserna för intra-esofagus irritation, skada och misslyckande eller avvisande av dammen på grund av hanteringen. Således två olika gavaging scheman testades och intestinal koloniseringen kvantifierades med DNA från hela tarmen homogenates. Möss var gavaged från DOL 2 till DOL 8 med probiotiska administreras varje dag eller varannan dag (figur 3). Varje prov innehöll en tekniskt replikera och varje skick hade minst två biologiska replikat. Pups gavaged hade varje dag med 7 doser cirka 103 kopior av LP medan valparna gavaged varannan dag med 4 doser hade cirka 105 exemplar. Resultaten mellan replikerar den överensstämmer lägga till kredit till precisionen av teknik. Det fanns fler LP upptäcks i tarmarna av pups gavaged varannan dag i jämförelse med valpar som var gavaged varje dag. Tanke på detta inrättades efterföljande experiment med en sondmatning schema av varannan dag eftersom det minskar också stress för valparna.
Det är viktigt att undvika intra-kullen probiotiska korskontaminering när du arbetar med probiotika. Mikrobiomet av Kullsyskonen förväntades vara liknande som de delar samma mor och häckande miljö. Detta bevisar ett problem för probiotiska studier om villkor för behandling och kontroll var närvarande inom samma kullen som probiotiska organismen har potential att bli en del av bakterieflora (”kolonisering sprida '). För att avgöra om en probiotisk kommer att förorena och kolonisera obehandlad littermates, hälften av en kull var gavaged som ovan och tarmarna samlades för qPCR. Intestinal qPCR analys av DOL 10 möss visade förväntade amplifiering av LP DNA i gavaged möss men också, i mindre grad i de icke-gavaged littermates (figur 4). Tarmarna av samma DOL möss från en obehandlad bur visade ingen förstärkning eller minimal förstärkning vid cykler större än 32. Detta gav bevis för att gemensamt dela mikrobiomet inom en kull i en bur. Således, för experiment med probiotika behandlingsgrupperna bör separeras av burar till kontrollen för variabilitet genom korskontaminering. Användning av foster dammar kan övervägas om ett experiment är att inrättas inom en kull inställning, men störande effekter som minskad vård från foster dammen och avslag bör utvärderas och optimerad för. När möss gavaged tills DOL 8 lämnades obehandlade i sex dagar och intestinal DNA analyserades DOL 14, hittades cirka 10 exemplar av LP (figur 5). Således, koloniseringen av LP befanns vara övergående och påvisbara befolkningen minskat över tid.
Figur 1 . Mäta längden mellan xiphoid processen (nedre delen av bröstbenet) och nosen att göra maximal insättning märkning för nålen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Standardkurvan etablerade använder LP primers och ATCC LP DNA. En seriell utspädning av ATCC LP DNA gjordes för att inrätta det dynamiska detekterbara omfånget för primers används i studien. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . LP amplifiering av intestinal DNA från DOL 10 valpar behandlade mellan DOL 2 och DOL 8 i schemalagda gavages varje dag (7 doser) och varannan dag (4 doser). Gavaging varannan dag visade högre intestinal LP i jämförelse med gavaging varje dag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . LP amplifiering av intestinal DNA från DOL 10 valpar 2 behandlade och 2 obehandlade i en kull på 4 ungar. Sondmatning var mellan DOL 2 och DOL 8 i schemalagda gavages varje dag (7 doser). De två probiotiska behandlades pups Visa beräknade förstärkning profilen. De obehandlade valparna visar variabel förstärkning av LP som anger gemensamma delar av den probiotiska organismen i en kull. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . LP amplifiering av intestinal DNA från DOL 14 valpar behandlade mellan DOL 2 och DOL 8 i schemalagda gavages varje dag (7 doser) och varannan dag (4 doser). De LP belastning sjunker under cykel 28 indikerande clearance av LP under loppet av 6 dagar efter sista probiotiska sondmatning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Temperatur | Tid |
| 1 | 50 ° C | 2 minuter |
| 2 | 95 ° C | 3 minuter |
| 3 | 95 ° C | 30 sekunder |
| 4 | 58 ° C | 30 sekunder |
| 5 | 72 ° C | 30 sekunder |
Tabell 1. qPCR förstärkning villkor. Temperatur och antal cykel villkor för PCR-reaktionen.
| Mål | 16s-23S intergenic spacer regionen |
| Förväntade fragment storlek | 144 bp |
| Primer Tm | 58˚C |
| Forward primer (FP) | LPN-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT |
| Reverse primer (RP) | LPN-2: TGT TCT CGG TTT katt TAT GAA AAA ATA |
Tabell 2. Detaljer för komponenter av qPCR reaktionen. Detaljer primers, sin glödgning temperatur och förväntade fragment storlek i PCR-reaktionen.
| Koncentration | 10 µL reaktion | 20 µL reaktion | |
| Templat-DNA | 200 pg/µL | 1 ΜL | 1 ΜL |
| SYBR Master Mix | - | 5 ΜL | 10 ΜL |
| FP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0.6 ΜL |
| RP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0.6 ΜL |
| dH2O | - | 3.4 ΜL | 8,8 ΜL |
Tabell 3. Per reaktion volymer och koncentrationer. Koncentrationen av reagenser och volymer för reaktioner.
Discussion
Förfarandet för IE sondmatning utvecklades för att tryggt administrera en viss dos av probiotika till nyfödda möss. Små mängder vätska levereras till övre mag-tarmkanalen med hjälp av en utfodring nål för att förhindra aspiration samtidigt säkerställa leverans av doseringen i förtroende. Tarmarna av mössen samlades för kolonisering analys två och sex dagar efter sondmatning. Förfarandet för DNA-extraktion ändrades för att säkerställa hög avkastning av probiotiska grampositiva organismen. QPCR analys av DNA extraheras två dagar efter sista sondmatning visade relativt högre koloniseringen av LP i möss gavaged varannan dag i jämförelse med möss gavaged varje dag mellan DOL 2-8. Det fanns också en minskning av mängden LP under sex dagar, visar denna probiotiska vara en övergående organism i tarmarna av musen. Resultaten av dessa experiment fastställa villkoren för att bedriva forskning med hög noggrannhet i denna åldersgrupp.
För att Observera de långsiktiga effekterna av probiotika hos neonatala möss, administrerades det till neonatala möss på DOL 2; en liknande starttid peka på mänskliga rättegången. Orofaryngeal utfodring av neonatala möss tidigare beskrivs i litteraturen och har de genomförts först efter DOL 5-812,17 , när risken för aspiration är lägre på grund av en väl utvecklad svälja mekanik. Orofaryngeal utfodring är dock inte väl lämpade för DOL 2 möss som högre priser för aspiration observerades i pilotstudien (inga data anges). Den trögflytande karaktären av probiotika och prebiotika lösningen tillsätts risken för aspiration. Efter förfarandet för IE-gavaging minimeras risken för aspiration i DOL 2 möss samtidigt leverera önskad volym direkt till övre mag-tarmkanalen. Framgången för förfarandet validerades först använda karamellfärg infunderas probiotiska sondmatning. Karamellfärg fungerar som en markör som syns genom huden av pup. Inga negativa effekter observerades hos möss gavaged med karamellfärg, och det rekommenderas att validera gavaging förfarandet på detta sätt innan storskaliga experiment. Den snabb lösningen på den flämtande reflex sett inlägget sondmatning kan också användas som en ytterligare indikator för en framgångsrik sondmatning. När musen är placerat på den värme filten efter sondmatning, flämtande reflexen kommer att avta och en ökning av andning frekvensen kommer att observeras inom 20 sekunder. En fortsättning av den flämtande reflexen längre än 30 sekunder indikerar en misslyckad sondmatning. Framgångsrika sondmatning beror också på lämpliga införande av utfodring nålen med den lampa som sitter precis ovanför öppnandet av hjärt sphincter av magen. Detta kan underlättas genom att säkerställa att märkningen på nålen mäta längden mellan xiphoid processen och spetsen på nosen, inte går förbi nosen i musen under sondmatning. Detta minimerar risken för skador till musen. Frekvensen av sondmatning kan ha en betydande inverkan på experimentella resultat. Frekvent gavaging kan också skapa mer stress för ungarna och mamman på grund av ständig störning av buren och boet. Mest optimala sondmatning schemat är när gavages är den minst frekventa och över en kortare tidsperiod utan att förlora den förväntade effekten i systemet. För att garantera säkerhet och sterilitet av förfarandet sondmatning måste nål steriliseras genom tvätt och autoklavering däremellan användning. Tvätta noggrant på utsidan med en scrub och insidan genom att tvinga vattnet genom nålen med en spruta innan autoklavering behövs eventuella överblivna partiklar kan encrust på nålen under autoklavering och kan störa förfarandet för gavaging.
Högre LP colonization observerades på ungar som var gavaged varannan dag jämfört med valpar gavaged varje dag. Detta kan bero på minskad stress på valpar gavaged varannan dag och potentiellt den probiotiska får mer näringsämnen genom de relativt mer mjölk som intas av dessa valpar. Sambandet dos probiotisk behandling har tidigare studerats i mus modeller18,19 och således administrationen av rätt dos är viktigt. Den probiotiska lösning som beretts är klädd innan varje sondmatning att få korrekt antal CFU administreras. Om probiotiska organismen är anaerob, är det viktigt att se om det finns skillnad i CFU när odlade aerobt eller anaerobt. Eftersom LP är en fakultativt anaeroba, det var odlade hjälp av båda metoderna och ingen skillnad i CFU observerades.
Inlägget sondmatning intestinal LP belastning analysen utfördes med hjälp av qPCR och högkvalitativa DNA-prover. För att minimera LP DNA kontaminering mellan behandling och kontrollgrupperna, olika utfodring nålar, biosäkerhet skåp och kirurgisk utrustning användes för att garantera högsta kvalitet prover. Korrekt mätning av probiotiska i tarmen krävs en optimerad metod för DNA-extraktion. Mest effektiva metoder för extraktion av DNA från avföring innebär flera pärla slog steg20,21,22. Denna metod antogs för utvinning av tarmbakterier med pärla misshandeln och observerades minskad representation (< 102 exemplar återvinns) av LP i hela tarmen DNA extraktion. LP är en Gram-positiv organism med en betydande mängd peptidoglykan i cellväggen, optimerades protokollet med en peptidoglykan upplösning steg med hjälp av lysozym23,24 tillsätts den enzymatiska lyseringsbuffert. Detta ökade andelen LP i samma tarm prov med större än två gånger. Lysozym behandling garanterar upplösningen av det yttre lagret medan den pärla som slog steg underlättar lys av organismen. Optimering av mängden vävnad, vilken typ av granat pärla och varaktigheten av störningar med pärlorna är nödvändigt för att erhålla optimal DNA produkter för att utföra en PCR-analys.
Den positiva effekten av probiotika ges som profylax eller behandling i de pre- och sikt nyfödda framgår i senaste studier25,26,27,28. Inrättandet av en ordentlig neonatal musmodell för probiotika är befogad att packa upp den skyddande effekten av probiotika. Detta protokoll som beskrivs här representerar en guide för forskare som är obekanta med neonatal mus arbete med probiotika. Trots problem med gnagare bakterieflora medan du studerar människors hälsa och sjukdom, kan denna metod utvidgas till forskning inriktad på att förstå förändringarna av mikrobiomet på grund av probiotika. Denna modell ger också en plattform för att studera värd-mikrob interaktion och immunsvar under loppet av olika utvecklingsstadier.
Disclosures
Någon intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Tack vare Animal Care anläggning personal och UBC veterinärerna för att utbilda och bistå i musen fungerar på BC Children's Hospital Research Institute. Tack till University of British Columbia och Institutionen för experimentell medicin för att finansiera studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
References
- Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges. International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).
- Lin, H. C., et al. Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).
- Panigrahi, P., et al. A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India. Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).
- Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development. Frontiers in Pediatrics. 5, 111 (2017).
- Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice? Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).
- Elazab, N., et al. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).
- Arrieta, M. C., et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152 (2015).
- Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges. Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).
- Qi, F., et al. Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32 (2017).
- Yang, J., et al. Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life. Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).
- Deshmukh, H. S., et al. The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice. Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).
- Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy. Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).
- Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).
- Costeloe, K., et al. A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial. Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).
- Kitajima, H., et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial. Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).
- Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG. Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).
- Preidis, G. A., et al. Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine. The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).
- Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).
- Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice. British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).
- Yu, Z., Morrison, M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).
- Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA. Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).
- Müller, A., et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).
- Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).
- Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria. Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955 (1991).
- Thomas, C. M., Versalovic, J.
- Tancredi, D. J.
- Bernardo, W. M., et al. Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis. Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).
- Aceti, A., et al. Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis. Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89 (2015).
