Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo
Summary
Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.
Abstract
A importância das culturas in vitro de 3D é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos. No entanto, a falta de reprodutibilidade experimental é uma das suas restrições. Produzir alguns resultados reproduzíveis de formação padrão deteriora-se a análise dos mecanismos subjacentes a auto-organização. Reduzir a variação em condições de cultura inicial, tais como a densidade celular e distribuição na matriz extracelular (ECM), é crucial para melhorar a repetibilidade de uma cultura 3D. Neste artigo, vamos demonstrar um procedimento simples mas eficiente para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter formações padrão altamente repetitivo. Um micromold com uma forma desejada foi fabricado usando fotolitos ou um processo de usinagem, e formou-se um bolso 3D em ECM contido em um cubo de gel de híbrido (HGC). Células altamente concentradas então foram injetadas no bolso, para que a forma de aglomerado celular combinado com a forma do molde fabricado. O trabalhador assalariado HGC permitido multi-direcional digitalização por sua rotação, o que permitiu a geração de imagens de alta resolução e captura a todo da estrutura do tecido mesmo que utilizou-se uma lente de ampliação baixa. Normais células epiteliais brônquicas humanas foram usadas para demonstrar a metodologia.
Introduction
A importância de uma cultura 3D, que melhor imita ambientes biológicos do que uma cultura 2D, é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos1,2,3. A interação entre as células e matriz extracelular (ECM) fornece pistas importantes sobre a morfogênese4,5. Muitas formações de tecido podem surgir apenas em ambientes 3D, como o dobramento processo6,7, invaginação8e formação tubular9,10. No entanto, inúmeras dificuldades impedem pesquisadores mudando a experiências 3D de experimentos 2D em um prato. Uma das principais dificuldades em experiências 3D é a questão da imagem 3D amostras. Em comparação com experimentos planares, aquisição de imagens 3D apropriadas é ainda um desafio em muitos casos. Em particular, a obtenção de uma imagem 3D é uma tarefa difícil quando o tamanho da amostra atinge o intervalo milímetros devido a grande profundidade focal das lentes de ampliação baixa. Por exemplo, a profundidade focal atinge mais de 50 µm quando uma lente de ampliação de 10x é usado enquanto o tamanho da célula única é normalmente inferior a 10 µm. Para melhorar a qualidade de imagem, sistemas de microscopia de alta tecnologia estão sendo desenvolvidos (por exemplo, dois fotões microscopia11 e sistema de microscopia de luz-folha12), mas sua disponibilidade é limitada devido ao seu preço caro. Como alternativa, temos desenvolvido anteriormente um híbrido gel de cubo (HGC) dispositivo13. O dispositivo é composto por dois tipos de hidrogel: agarose como um gel de apoio e um ECM como colágeno ou Matrigel como um gel de cultura. O HGC nos permite coletar a amostra durante o cultivo e girar o cubo para alcançar a imagem multi-direcional, que aborda o problema de profundidade focal14.
Outra dificuldade em experiências 3D é sua baixa repetibilidade devido a pobre controlabilidade dos ambientes 3D. Ao contrário de uma cultura planar sobre um prato de plástico, facilmente ocorrer variações nas condições de cultura inicial em um espaço 3D, rodeado por um material macio. Uma variação significativa nos resultados experimentais deteriora-se a seguinte análise e mascara os mecanismos subjacentes. Muitas tecnologias de engenharia têm sido desenvolvidas para alinhar espacialmente células únicas, tais como bioprinting15,16, fibra tecelagem17e andaimes18, mas eles exigem complexo pré-processamento ou especificamente equipamento projetado. Em contraste, nós desenvolvemos uma metodologia para atingir o alinhamento da célula 3D em uma HGC19.
Neste protocolo, ilustramos um procedimento simples com equipamentos comumente usados para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial 3D em uma HGC. Demonstrou-se em primeiro lugar, o processo de fabricação do HGC. Então, micromolds fabricadas por fotolitografia ou um processo de usinagem foram colocados no HGC para produzir um bolso com uma forma arbitrária em um ECM. Posteriormente, células altamente densas após centrifugação foram injetadas no bolso para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial no HGC. O cluster de célula precisamente controlada poderia ser fotografado partir de várias direções por causa do HGC. Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar o controle da forma de aglomerado de pilha inicial e a imagem latente dos ramos de múltiplas direções para melhorar a qualidade de imagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado neste trabalho é simples e pode ser realizado sem equipamentos de alta tecnologia. Simultaneamente, pode ser obtido um resultado do controle precisos célula aglomerado forma no espaço 3D de hidrogel. Após o controle inicial, as células podem crescer na HGC tanto quanto eles são cultivados em um prato. A imagem multi direcional é executada girando-se a amostra com o HGC usando qualquer sistema de microscopia e melhora significativamente a qualidade de imagem. A escolha dos materiais para o fra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado financeiramente pela KAKENHI JSPS (18H 04765) e o programa para divulgar sistema de trilha de posse, MEXT, Japão.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referências
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
