Erste 3D Cluster Zellkontrolle in einem Hybrid Gel Cube Gerät für wiederholbare Muster Formationen
Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Verfahren zur Steuerung der erste Zellform der Cluster in einer 3D extrazelluläre Matrix, eine wiederholbare Musterbildung zu erhalten. Eine kubische Gerät mit zwei verschiedenen Hydrogele wird eingesetzt, um Multi-direktionalen Imaging für Gewebebildung Muster zu erreichen.
Abstract
Die Bedeutung der in-vitro-3D Kulturen wird deutlich im Zellgewebe/Kultur betont. Jedoch ist der Mangel an experimentellen Wiederholbarkeit eines seine Einschränkungen. Einige wiederholbare Resultate der Musterbildung, verschlechtert sich die Analyse der Mechanismen, die die Selbstorganisation. Reduzierung Variation im ersten Kulturbedingungen, wie z. B. die Zelldichte und Verteilung in der extrazellulären Matrix (ECM), ist entscheidend für die Wiederholbarkeit von 3D Culture zu verbessern. In diesem Artikel zeigen wir eine einfache, aber robuste Verfahren zur Steuerung der erste Zellform der Cluster in einer 3D extrazelluläre Matrix sehr wiederholbare Muster Formationen zu erhalten. Micromold mit einer gewünschten Form mittels Photolithographie oder einer Bearbeitung hergestellt wurde, und bildete eine 3D Tasche in das ECM in einem Hybrid-Gel-Cube (HGC) enthalten. Hochkonzentrierte Zellen wurden dann in der Tasche injiziert, so dass die Zellform-Cluster mit den vorgefertigten Form aufeinander abgestimmt. Die eingesetzten HGC erlaubt Multi-direktionalen Abtastung durch seine Drehung, die hochauflösende Bildgebung und die Erfassung der gesamten Gewebestruktur ermöglicht, obwohl eine niedrige Vergrößerungslinse verwendet wurde. Normalen menschlichen bronchiale Epithelzellen wurden verwendet, um die Methodik zu demonstrieren.
Introduction
Die Bedeutung von einem 3D Culture, die biologische Umgebungen besser imitiert als eine 2D Kultur tut, ist deutlich im Zellgewebe/Kultur1,2,3betont. Die Interaktion zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) bietet wichtige Hinweise bezüglich Morphogenese4,5. Viele Gewebe Formationen können nur unter 3D Umgebungen, z. B. die klappbare Prozess6,7, Einstülpen8und röhrenförmigen Bildung9,10entstehen. Jedoch verhindern, dass zahlreiche Schwierigkeiten Forscher Verlagerung auf 3D Experimente von 2D Experimente auf einen Teller geben. Eine der Hauptschwierigkeiten in 3D Experimenten ist die Frage der bildgebenden 3D Proben. Verglichen mit planaren Experimente, ist Erwerb der entsprechenden 3D-Bilder in vielen Fällen immer noch herausfordernd. Insbesondere ist die Erlangung einer entsprechenden 3D Bild eine schwierige Aufgabe, wenn die Stichprobengröße Millimeterbereich aufgrund großer Fokustiefe Low-Vergrößerung Objektive erreicht. Beispielsweise erreicht die Schärfentiefe mehr als 50 µm bei einer 10-fach Vergrößerung Objektiv verwendet wird, während die Größe der einzelnen Zelle normalerweise weniger als 10 µm beträgt. Um die Bildqualität zu verbessern, werden High-Tech-Mikroskopiesysteme entwickelt (z. B. zwei-Photonen-Mikroskopie11 und Licht-Blatt Mikroskopie System12), aber ihre Verfügbarkeit ist begrenzt aufgrund ihrer teuren Preis. Als Alternative haben wir zuvor ein Hybrid Gel Cube (HGC) Gerät13entwickelt. Das Gerät besteht aus zwei Arten von Hydrogele: Agarose als eine Unterstützung Gel und einem ECM wie Kollagen oder Matrigel als Kultur Gel. Die HGC ermöglicht es uns, sammeln der Probenmaterials während der Kultivierung und drehen Sie den Würfel um Multi-direktionalen Bildgebung zu erreichen, richtet sich die Fokustiefe Problem14.
Eine weitere Schwierigkeit in 3D Experimenten ist ihre geringe Reproduzierbarkeit aufgrund der schlechten Steuerbarkeit der 3D Umgebungen. Im Gegensatz zu einer planaren Kultur auf einer Plastikschale treten Abweichungen in der anfänglichen Kulturbedingungen leicht in einem 3D Raum, umgeben von einem weichen Material. Eine signifikante Variation in den experimentellen Ergebnissen verschlechtert sich die folgende Analyse und Masken die zugrunde liegenden Mechanismen. Viele Technologien wurden entwickelt, um räumlich ausrichten einzelne Zellen, z. B. Bioprinting15,16, Faser weben17und Gerüste18, aber sie erfordern komplexe Vorverarbeitung oder speziell konstruierte Geräte. Im Gegensatz dazu haben wir eine Methodik zur Erreichung 3D Zellausrichtung in eine HGC19entwickelt.
In diesem Protokoll dargestellt wir ein einfaches Verfahren mit häufig verwendeten Ausrüstung zur Steuerung der 3D ursprünglichen Cluster Zellform in eine HGC. Zunächst zeigte sich der Fertigungsprozess von der HGC. Dann wurden Micromolds hergestellt von Photolithographie oder Bearbeitungsvorgang in der HGC, eine Tasche mit einer beliebigen Form in einem ECM zu produzieren gelegt. Hoher Dichte Zellen nach Zentrifugation wurden anschließend in die Tasche zu steuern, die erste Zellform der Cluster in der HGC injiziert. Die präzise gesteuerte Zelle Cluster könnte aus vielen Richtungen wegen der HGC abgebildet werden. Normalen menschlichen Bronchien (NHBE) Epithelzellen wurden verwendet, um die Kontrolle über die ursprünglichen Cluster Zellform und Bildgebung der Zweige aus mehreren Richtungen zur Verbesserung der Bildqualität zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Whitepaper vorgestellte Methode ist einfach und kann ohne High-Tech-Ausrüstung durchgeführt werden. Gleichzeitig erhalten Sie eine präzise Zelle Cluster Form Kontrollergebnis im 3D-Raum Hydrogel. Nach der ersten Kontrolle können die Zellen in der HGC wachsen, wie sie auf einem Teller kultiviert sind. Die Multi-direktionale Bildgebung erfolgt durch Drehen der Probenmaterials mit der HGC mit jedem Mikroskopie-System, und es verbessert erheblich die Bildqualität. Die Wahl der Materialien für die HGC Rahmen u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (18 H 04765) und das Programm zu verbreiten Tenure-Track-System, MEXT, Japan finanziell unterstützt.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
Referências
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