用于可重复模式形成的混合凝胶立方体器件中的初始三维单元群集控制
Summary
我们提出了一个控制三维细胞外基质中初始细胞簇形状的过程, 以获得可重复的模式形成。采用含有两种不同水凝胶的立方装置, 实现组织形态形成的多向成像。
Abstract
体外3D 培养在细胞组织培养中的重要性得到了很大的强调。然而, 缺乏实验重复性是其限制之一。产生少量可重复的模式形成结果会破坏对自组织机制的分析。减少初始培养条件的变化, 如细胞密度和细胞外基质 (ECM) 中的分布, 对于提高3D 培养的可重复性至关重要。在本文中, 我们演示了一个简单而可靠的过程, 用于控制三维细胞外基质中的初始细胞簇形状, 以获得高度可重复的模式形成。利用光刻技术或加工工艺制备了一种具有所需形状的微极本, 并在混合凝胶立方体 (HGC) 中的 Ecm 中形成了三维口袋。然后将高浓度的细胞注入口袋, 使细胞簇形状与制造的模具形状相匹配。所使用的 HGC 通过旋转实现了多方向扫描, 即使使用了低放大透镜, 也实现了高分辨率成像和整个组织结构的捕获。采用正常人支气管上皮细胞对该方法进行了验证。
Introduction
3d 培养比2d 培养更能模仿生物环境, 在细胞组织培养1,2,3中得到了很大的强调。细胞与细胞外基质 (ecm) 之间的相互作用为形态发生 4、5 提供了重要线索。许多组织形成只能在三维环境下出现, 如折叠过程6,7, 侵入 8, 和管状形成 9,10。然而, 许多困难使研究人员无法从盘子上的2D 实验转向三维实验。3D 实验的主要困难之一是3D 样品的成像问题。与平面实验相比, 在许多情况下, 获取合适的3D 图像仍然具有挑战性。特别是, 当样品尺寸达到毫米范围时, 由于低放大倍率镜头的焦距较大, 获得合适的3D 图像是一项艰巨的任务。例如, 当使用10倍放大镜时, 焦距超过 50μm, 而单个单元的大小通常小于10μm。为了提高成像质量, 正在开发高技术显微镜系统 (例如双光子显微镜11和光片显微镜系统12), 但由于价格昂贵, 这些系统的供应有限。作为替代方案, 我们以前开发过混合凝胶立方体 (HGC) 设备13。该装置由两种类型的水凝胶组成: 琼脂糖作为支撑凝胶和 ECM, 如胶原蛋白或 Matrigel 作为培养凝胶。HGC 允许我们在培养和旋转立方体的过程中收集样本, 以实现多向成像, 从而解决焦距问题14。
3D 实验的另一个困难是由于3D 环境的可控性较差, 因此其可重复性较低。与塑料盘上的平面培养不同, 初始培养条件的变化很容易发生在被软材料包围的3D 空间中。实验结果的一个显著变化会恶化以下分析, 并掩盖潜在的机制。许多工程技术已经开发出来, 空间对齐单个细胞, 如生物印迹15,16,纤维编织17, 脚手架 18, 但它们需要复杂的预处理或专门设计的设备。相反, 我们开发了一种方法来实现 HGC19中的3d 细胞对齐。
在该协议中, 我们用常用的设备说明了一个简单的过程, 用于控制 HGC 中的三维初始细胞簇形状。首先, 对 HGC 的制造工艺进行了论证。然后, 在 HGC 中放置用光刻或加工工艺制作的微型光片, 以生产 ECM 中任意形状的口袋。随后, 离心后将高密度细胞注入口袋, 以控制 HGC 中的初始细胞簇形状。由于 HGC 的存在, 精确控制的细胞群可以从多个方向进行成像。正常的人支气管上皮细胞 (NHBE) 被用来证明控制最初的细胞簇形状和从多个方向的分支成像, 以提高成像质量。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文提出的方法简单, 无需高科技设备即可实现。同时, 在水凝胶的三维空间中, 可以得到精确的细胞簇形状控制结果。在最初的控制之后, 细胞可以在 HGC 中生长, 就像它们在盘子上培养一样多。多向成像是通过使用任何显微镜系统将样品与 HGC 旋转来完成的, 它显著提高了成像质量。HGC 框架和微工具的材料选择是灵活的, 只要它们是生物相容性的。如果3D 打印机的精度足以满足其应用要求, 则可使?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了日本 JPS KAKENHI (18H04765) 和日本 MEXT 的传播保有权跟踪系统方案的财政支持。
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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