Nuoto paralisi indotta a valutare dopamina segnalazione in Caenorhabditis elegans
Summary
Nuoto indotta paralisi (SWIP) è un’analisi comportamentale consolidata utilizzata per studiare i meccanismi di fondo di dopamina segnalazione in Caenorhabditis elegans (c. elegans). Tuttavia, manca un metodo dettagliato per eseguire il test. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per SWIP.
Abstract
Il saggio di nuoto descritto in questo protocollo è un valido strumento per identificare le proteine che regolano il dopaminergico sinapsi. Simili ai mammiferi, dopamina (DA) controlla diverse funzioni in c. elegans , tra cui attività di apprendimento e motore. Condizioni che stimolano il rilascio di DA (per esempio, trattamenti di anfetamina (AMPH)) o che impediscono DA liquidazione (ad es., gli animali manca il trasportatore DA (dat-1) che sono in grado di reaccumulating DA nei neuroni) generare un eccesso di extracellulare DA che si traduce nella locomozione inibito. Questo comportamento è particolarmente evidente quando animali nuotare in acqua. Infatti, mentre animali di selvaggio-tipo continuano a nuotare per un periodo prolungato, dat-1 mutanti e wild-type trattati con AMPH o inibitori del trasportatore DA depositano sul fondo del pozzo e non si muovono. Questo comportamento viene definito “Nuoto indotta paralisi” (SWIP). Anche se il dosaggio SWIP è ben consolidato, una descrizione dettagliata del metodo è carente. Qui, descriviamo una guida dettagliata per eseguire SWIP. Per eseguire il test, tardi larvali fase-4 animali sono posti in una lastra di vetro posto contenente soluzione di saccarosio di controllo con o senza AMPH. Gli animali sono notati per il loro comportamento di nuoto o manualmente da visualizzazione sotto uno stereoscopio o automaticamente registrando con una telecamera montata sullo stereoscopio. Video vengono poi analizzati utilizzando un software di monitoraggio, che produce una rappresentazione visiva di frequenza thrashing e paralisi sotto forma di mappe di calore. Entrambi i sistemi manuali e automatizzati garantiscono una lettura facilmente quantificabile di abilità nel nuoto degli animali e quindi facilitano lo screening per gli animali recanti mutazioni all’interno del sistema dopaminergico o per geni ausiliari. Inoltre, SWIP utilizzabile per delucidare il meccanismo d’azione dei farmaci di abuso come AMPH.
Introduction
Animali eseguono una serie di comportamenti innati e complessi che sono mediati da diversi neurotrasmettitori coordinati da intricati processi di segnalazione. Il neurotrasmettitore dopamina (DA) media comportamenti altamente conservati tra le specie, compreso l’apprendimento, la funzione di motore ed elaborazione di ricompensa.
C. elegans, il nematode del terreno con un sistema nervoso relativamente semplice e ben mappato consistente solo 302 neuroni, Mostra comportamenti marcatamente complessi, compreso molti che sono disciplinati DA come accoppiamento, apprendimento, foraggiamento, locomozione e deposizione delle uova 1. tra le altre caratteristiche, ciclo di vita breve, facilità di manipolazione e la conservazione delle molecole di segnalazione, evidenziare i vantaggi dell’utilizzo di c. elegans come modello per studiare le basi neurali dei comportamenti conservati.
L’Ermafrodito di c. elegans contiene otto neuroni dopaminergici; Oltre a questi, il maschio contiene sei paia supplementare per scopi di accoppiamento. Come nei mammiferi, questi neuroni sintetizzano DA ed esprimere il trasportatore DA (DAT-1), una proteina di membrana presenti esclusivamente nei neuroni dopaminergici, che trasporta DA rimessi nella fessura sinaptica in neuroni dopaminergici. Inoltre, la maggior parte delle proteine coinvolte in ogni fase di sintesi e rilascio di DA imballaggi sono altamente conservata tra vermi e gli esseri umani e, come nei mammiferi, DA modula alimentazione comportamenti e locomozione in c. elegans2.
C. elegans per indicizzazione su superfici solide e nuota con un comportamento caratteristico thrashing in acqua. È interessante notare che, mutanti privi di espressione di DAT-1 (dat-1) scansione normalmente su superficie solida ma non riescono a sostenere nuoto quando immerso in acqua. Questo comportamento è stato definito nuoto indotta paralisi o SWIP. Precedenti esperimenti hanno dimostrato che SWIP, in parte, è causata da un eccesso di DA nella fessura sinaptica che in ultima analisi overstimulates i recettori postsinaptici D2-like (DOP-3). Anche se originariamente identificato nel dat-1 knockout animali3, SWIP è osservato anche in animali trattati con farmaci che bloccano l’attività del DAT (ad es., imipramina4) e/o indurre il rilascio di DA (ad esempio, anfetamina5). D’altra parte, manipolazioni farmacologiche o genetiche evitanti la sintesi ed il rilascio di DA e blocco della funzione del recettore DOP-3 prevenire SWIP6. Presi insieme, questi dati già pubblicati hanno stabilito SWIP come uno strumento affidabile per studiare gli effetti del comportamento causati da proteine mutate entro dopaminergici sinapsi3,4,7 e possono essere impiegati per avanti schermi genetici per l’identificazione dei nuovi meccanismi normativi nei DA segnalazione7,8,9,10,11,12. Inoltre, fornendo una lettura facilmente quantificabile di comportamento farmaco-indotta in animali viventi, SWIP consente la delucidazione dei meccanismi di azione delle droghe come anfetamina (AMPH) e azaperone presso dopaminergiche sinapsi5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocolli per eseguire i dosaggi SWIP sono state descritte prima16. Qui, descriviamo dettagliatamente la metodologia e il programma di installazione per eseguire l’analisi con l’obiettivo di fornire una guida visiva per la comunità di c. elegans svolgere efficacemente SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per eseguire un’analisi comportamentale, SWIP, c.elegans. Questo protocollo è semplice e lineare con nessun principali ostacoli tecnici, rendendo questo test molto facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni aspetti critici che devono essere considerati al fine di svolgere efficacemente il dosaggio.
Prestare la massima attenzione per garantire che i vermi utilizzati per il dosaggio sono ben nutriti, dal momento che la restrizione dietetica col…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il dottor Osama Refai dal laboratorio del Dr. Randy Blakely per guida con l’analisi automatizzata di SWIP. Quest’opera è stata sostenuta da finanziamenti da NIH R01 DA042156 LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
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