Yüzme felç indüklenen Caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için
Summary
Yüzme indüklenen felç (SWIP) olan köklü bir davranış tahlil Caenorhabditis elegans içinde (C. elegans) sinyal dopamin temel mekanizmaları çalışırdım. Ancak, tahlil gerçekleştirmek için detaylı bir yöntem bulunmamaktadır. Burada, SWIP için bir adım adım Protokolü açıklar.
Abstract
Bu protokol için açıklanan Yüzme tahlil dopaminerjik düzenleyen proteinler tanımlamak için geçerli bir araç synapses olduğunu. Benzer şekilde memeliler, dopamin (DA) C. elegans öğrenme ve motor aktivite de dahil olmak üzere çeşitli işlevlerini kontrol eder. Bu DA yayın (örneğin, amfetamin (AMPH) tedavileri) teşvik veya DA izni engel koşulları (örneğin, hayvanlar DA ışınlama eksik (dat-1) DA nöronların reaccumulating aciz olan) hücre dışı DA aşırı oluşturmak Sonuçta ortaya çıkan Inhibe gezisidir. Bu davranış özellikle belirgin olduğunda hayvanlar yüzmek. Aslında, uzun bir süre için yüzmeyi vahşi-türü hayvanlar devam ederken, dat-1 boş mutantlar ve vahşi-tipi AMPH ile tedavi veya DA ışınlama inhibitörleri Kuyunun dibine batırın ve hareket etmiyor. Bu davranış “Yüzme felç” (SWIP) indüklenen olarak adlandırılır. SWIP tahlil iyi kurulmuş olsa da, yöntemin ayrıntılı bir açıklama bulunmuyor. Burada, SWIP gerçekleştirmek için adım adım yönergeler açıklanmaktadır. Tahlil gerçekleştirmek için geç larva sahne-4 hayvan kontrol Sükroz çözümü ile ya da ezelî AMPH içeren bir cam spot levha yerleştirilir. Hayvanlar için bir stereoscope altında görselleştirme tarafından el ile veya otomatik olarak kayıt ile bir fotoğraf makinesi üzerinde stereoscope monte Yüzme davranışlarını attı. Videolar sonra dayak frekans ve felç ısı haritaları şeklinde görsel bir gösterimini verir bir izleme yazılımı kullanılarak analiz edilir. El ile ve otomatik sistemler ve hayvanların Yüzme yeteneği kolayca ölçülebilir bir okuma garanti böylece tarama için mutasyonlar dopaminerjik sistem içinde taşıyan hayvan veya yardımcı genler için kolaylaştırmak. Buna ek olarak, SWIP kötüye AMPH gibi ilaçların etki mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir.
Introduction
Hayvanlar farklı nörotransmitter karmaşık sinyalleşme işlemler tarafından koordine tarafından aracılı doğuştan gelen ve karmaşık davranışlar çeşitli gerçekleştirmek. Nörotransmitter dopamin (DA) son derece korunmuş davranışlar öğrenme, motor işlevleri ve ödül işleme gibi türler arasında aracılık eder.
Toprak Yuvarlak solucanlar C. elegans, nispeten basit ve de eşlenen sinir sadece 302 nöronlar oluşan sistemi ile belirgin karmaşık davranışları DA çiftleşme, öğrenme, yiyecek arama, hareket ve yumurta atma gibi düzenlenir da dahil olmak üzere, gösterir 1. diğer özellikleri arasında kısa yaşam döngüsü, kullanım kolaylığı ve moleküller sinyal koruma, C. elegans korunmuş davranışları nöral temeli eğitimi için bir model olarak kullanmanın yararları vurgulayın.
C. elegans hermafrodit sekiz dopaminerjik nöron içerir; Bunlara ek olarak, altı ilave çiftlerini amaçlar çiftleşme için erkek içerir. Memeliler, olduğu gibi bu nöronlar DA sentez ve DA ışınlama (DAT-1), hangi DA sinaptik yarık geri dopaminerjik nöron serbest nakliye sadece dopaminerjik nöronlarda bulunan bir membran protein ifade eder. Ayrıca, çoğu protein sentezi, paketleme ve serbest bırakmak-in DA her adımda dahil solucanlar ve insanlar arasında son derece korunmuş ve gibi memelilerde DA beslenme davranışları ve hareket C. elegans2modüle.
C. elegans düz yüzeylerde tarar ve karakteristik dayak davranış suda yüzüyor. İlginçtir, DAT-1 (dat-1) ifadesi eksik mutantlar normalde katı yüzey üzerinde tarama ama suya dalmış zaman Yüzme ayakta tutmak başarısız. Bu davranış indüklenen Yüzme felç veya SWIP olarak adlandırdığı oldu. Önceki deneyler SWIP, kısmen DA sonuçta D2-benzeri postsinaptik reseptörler (DOP-3) overstimulates sinaptik yarık içinde aşırı kaynaklanır gösterdi. Her ne kadar başlangıçta dat-1 nakavt hayvanlar3‘ te tanımlanan, SWIP da o blok faaliyet DAT (örneğin, imipramine4) ilaçlar ile tedavi vahşi-türü hayvanlarda gözlenen ve/veya DA yayın (örneğin, amfetamin5) ikna etmek. Öte yandan, sentez ve serbest bırakmak-in DA önlenmesi ve engelleme DOP-3 reseptör fonksiyonu farmakolojik veya genetik manipülasyon SWIP6önlemek. Birlikte ele alındığında, bu zaten yayımlanmış veri SWIP mutasyona uğramış proteinlerin dopaminerjik sinapslarda3,4,7 içinde neden davranışsal etkileri çalışmaya ve için istihdam için güvenilir bir araç olarak kurduk kimliği roman yasal yolları7,8,9,10,11,12sinyal DA dahil ileri genetik ekranlar. Buna ek olarak, uyuşturucu kaynaklı davranış yaşayan hayvanlarda kolayca ölçülebilir bir okuma sağlayarak, SWIP mekanizmaları eylem amfetamin (AMPH) gibi ilaçlar aydınlatma sağlar ve azaperone dopaminerjik,5, synapses 6 , 13 , 14 , 15.
SWIP deneyleri yerine getirmek için kullanılan protokolleri16daha önce anlatmıştık. Metodoloji ve etkili bir şekilde SWIP gerçekleştirmek C. elegans toplum için görsel bir kılavuz sağlamak amacı ile tahlil yapmak için Kur’u burada, biz ayrıntılı olarak tarif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir davranış yöntemi, SWIP, C. elegansiçinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı bu tahlil çok kullanıcı dostu yapmak hiçbir büyük teknik engel ile basit ve anlaşılır. Yine de, etkili bir şekilde tahlil gerçekleştirmek için dikkat edilmesi gereken bazı önemli yönleri vardır.
Diyet kısıtlama SWIP17etkiler bu yana tahlil için kullanılan solucanlar iyi beslenmiş olması için özen g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Osama Refai Dr Randy Blakely’nın Lab SWIP otomatik analizi ile rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser NIH R01 DA042156 LC için fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
