游泳诱导麻痹对线虫多巴胺信号的评价
Summary
游泳诱导麻痹 (SWIP) 是一种成熟的行为检测方法, 用于研究线虫中多巴胺信号的潜在机制.然而, 缺乏一个详细的方法来执行该检测。在这里, 我们描述了 SWIP 的分步协议。
Abstract
该方案中描述的游泳检测方法是识别调节多巴胺能突触的蛋白质的有效工具。与哺乳动物类似, 多巴胺 (DA) 控制着线虫的多种功能, 包括学习和运动活动。刺激 DA 释放 (例如, 安非他明 (AMPH) 处理) 或阻止 DA 清除的条件 (例如, 缺乏 DA 转运体 (dat-1)的动物无法将 da 重新积累到神经元中) 会产生过量的细胞外 da最终导致抑制运动。当动物在水中游泳时, 这种行为尤其明显。事实上, 虽然野生类型的动物继续游泳很长一段时间, dat-1空突变体和野生类型处理的 amph 或 da 转运体抑制剂下沉到井底, 不移动。这种行为被称为 “游泳诱发麻痹” (SWIP)。虽然 SWIP 检测已经建立, 但缺乏对该方法的详细描述。在这里, 我们介绍了执行 SWIP 的分步指南。为了进行检测, 将幼虫后期阶段-4 动物放置在含有控制蔗糖溶液的玻璃光板中, 无论是否有 AMPH。动物的游泳行为得分, 或者通过立体镜下的可视化, 或者通过使用安装在立体镜上的相机自动录制。然后使用跟踪软件对视频进行分析, 该软件以热图的形式直观地表示了撞击频率和瘫痪。手动和自动化系统都保证了动物游泳能力的容易量化读数, 从而便于筛选多巴胺能系统内带有突变的动物或辅助基因。此外, 社会福利和儿童保护方案可用于阐明 AMPH 等滥用药物的行动机制。
Introduction
动物执行各种先天和复杂的行为, 这些行为由复杂的信号转导过程协调的不同神经递质介导。神经递质多巴胺 (DA) 介导不同物种高度保守的行为, 包括学习、运动功能和奖励处理。
土壤线虫的神经系统相对简单, 只有302个神经元, 表现出明显复杂的行为, 包括许多由 da 调节的行为, 如交配、学习、觅食、运动和产蛋1. 除其他特点外, 寿命周期短、处理方便和信号分子的守恒, 突出了使用线虫作为研究保守行为的神经基础的模型的优势。
雌雄同体线虫含有8个多巴胺能神经元;除此之外, 雄性还为交配目的多了六个对。与哺乳动物一样, 这些神经元合成 DA 并表达 da 转运体 (DAT-1), 这是一种单不在多巴胺能神经元中的膜蛋白, 它将突触裂隙中释放的 DA 转运回多巴胺能神经元。此外, 在 DDA 的合成、包装和释放的每一步中, 大多数蛋白质都是高度保守的, 在蠕虫和人类之间, 与哺乳动物一样, da 调节线虫2 中的喂养行为和运动。
线虫在固体表面上爬行, 并在水中游泳, 具有特有的撞击行为。有趣的是, 缺乏 dat-1 (dat-1) 表情的突变体在固体表面上正常爬行, 但在水中浸泡时无法维持游泳。这种行为被称为游泳引起的麻痹, 或 SWIP。先前的实验表明, SWIP 在一定程度上是由突触裂隙中的 DA 过多引起的, 最终过度刺激 D2 样突触后受体 (DOP-3)。虽然最初是在dat-1型淘汰赛动物 3中发现的, 但在使用阻止 dat 活性的药物 (例如, imipamine4) 和/或诱导 da 释放 (例如苯丙胺5) 的药物治疗的野生类型动物中也观察到了 swip。另一方面, 避免 da 的合成和释放以及阻断 DOP-3 受体功能的药理或遗传操作可以防止 SWIP6。总之, 这些已经公布的数据已经确定了 swip 作为一个可靠的工具, 研究突变蛋白在多巴胺能突触 3,4,7和用于前基因屏幕, 用于识别涉及 da 信号7、8、9、10、11、12 的新调控途径。此外, 通过提供药物诱导的活体动物行为的易于量化的读数, swip 可以阐明药物 (如安非他明 (AMPH) 和偶酮类药物在多巴胺能突触5的作用机制,6,13,14,15岁
执行 SWIP 检测的协议已在16之前描述过。在这里, 我们详细介绍了执行检测的方法和设置, 目的是为线虫社区提供一个视觉指南, 以有效地执行 swip。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个分步的协议, 以执行行为分析, swip, 在c. elegans。这个协议简单而直接, 没有重大的技术障碍, 使这种检测非常方便用户。然而, 为了有效地进行检测, 还需要考虑一些关键的方面。
应注意确保用于检测的蠕虫吃得很好, 因为饮食限制会影响 SWIP17。在采摘过程中对蠕虫进行温和处理, 以及在裂解过程中及时处理次氯酸钠/naoh 治疗是关…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢兰迪·布莱克利博士实验室的 Osama Refai 博士对 SWIP 的自动化分析提供的指导。这项工作得到了国家卫生研究院 R01 DA042156 到 LC 的资助。
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
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