Svømming indusert lammelse å vurdere dopamin signalering i Caenorhabditis elegans
Summary
Svømming indusert lammelse (SWIP) er en veletablert atferdsdata analyse brukes til å studere de underliggende mekanismene av dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Imidlertid mangler en detaljert metode til å utføre analysen. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for SWIP.
Abstract
Svømming analysen beskrevet i denne protokollen er et gyldig verktøy for å identifisere proteiner regulere dopaminergic synapser. Ligner på pattedyr, dopamin (DA) kontrollerer flere funksjoner i C. elegans inkludert læring og motor aktivitet. Vilkår som stimulerer DA utgivelsen (f.eks amfetamin (AMFOTÆR) behandlinger) eller det hindre DA klaring (f.eks dyr mangler den DA transporter (dat-1) som er i stand til reaccumulating DA i nervecellene) generere et overskudd av ekstracellulære DA til slutt resulterte i hemmet bevegelse. Dette er spesielt tydelig når dyr svømme i vann. Faktisk, vill-type dyr fortsetter å svømme lengre, dat-1 null mutanter og vill-type behandlet med AMFOTÆR eller hemmere av den DA transporter synke å bunnen av brønnen og ikke flytte. Dette kalles “Svømming indusert lammelse” (SWIP). Selv om SWIP analysen er godt etablert, mangler en detaljert beskrivelse av metoden. Her beskriver vi en trinnvis veiledning for å utføre SWIP. For å utføre analysen, er sent larver scenen-4 dyr plassert i et glass spotplate som inneholder kontrollen sucrose løsning med eller uten AMFOTÆR. Dyr er scoret for svømming virkemåten manuelt ved visualisering under en stereoscope, eller automatisk ved opptak med et kamera montert på stereoscope. Videoer blir deretter analysert ved hjelp av en sporingsprogramvare, som gir en visuell representasjon av juling frekvens og lammelse i form av varme kart. Begge de manuelle og automatiserte systemene garanterer en lett kvantifiserbare avlesning av dyr bading evne og dermed forenkle screening for dyrene bærer mutasjoner i dopaminergic systemet eller Aux gener. I tillegg kan SWIP brukes til å belyse virkningsmekanismen av narkotiske stoffer som AMFOTÆR.
Introduction
Dyr utføre en rekke medfødt og komplekse atferd som er formidlet av ulike nevrotransmittere koordinert av intrikate signalnettverk prosesser. Nevrotransmitter dopamin (DA) formidler høyt konservert atferd over arter, inkludert læring, funksjon og belønning behandling.
Jord-Rundormer C. elegans, med en relativt enkel og godt kartlagt nervesystemet som består av bare 302 neurons, viser markant komplekse atferd, inkludert mange som reguleres av DA som parring, læring, foraging, bevegelse og egglegging 1. blant andre funksjoner, korte livssyklusen, enkel håndtering og bevaring av signalnettverk molekyler, fremheve fordelene med C. elegans som modell for å studere nevrale grunnlag av bevarte atferd.
Hermafroditt C. elegans inneholder åtte dopaminergic neurons; I tillegg til disse inneholder mannlige seks ekstra par parring formål. Som i pattedyr, disse neurons syntetisere DA og uttrykke den DA transporter (DAT-1), en membran protein som finnes i dopaminergic neurons, som transporterer DA sluppet i den synaptiske kløften tilbake i dopaminergic neurons. Videre, de fleste av proteiner involvert i hvert trinn av syntese, emballasje og utgivelsen av DA er svært bevart mellom ormer og mennesker, og som i pattedyr, DA modulerer fôring atferd og bevegelse i C. elegans2.
C. elegans kryper på solide flater og svømmer med en karakteristisk juling atferd i vann. Interessant, mutanter mangler uttrykk for DAT-1 (dat-1) gjennomgå normalt på solid overflate, men klarer ikke å opprettholde svømming når nedsenket i vann. Dette ble kalt svømming indusert lammelse eller SWIP. Tidligere eksperimenter har vist at SWIP, delvis er forårsaket av et overskudd av DA i den synaptiske kløften som til slutt overstimulates D2-like postsynaptic reseptorer (DOP-3). Selv om opprinnelig identifisert i dat-1 knockout dyr3, SWIP er også observert i vill-type dyr behandlet med medikamenter som blokkerer aktiviteten av DAT (f.eks imipramin4) og/eller indusere DA utgivelsen (f.eks amfetamin5). På den annen side, forhindrer farmakologiske eller genetiske manipulasjoner avverge syntese og utgivelsen av DA og blokkering DOP-3 reseptor funksjonen SWIP6. Sammen har disse allerede publiserte data etablert SWIP som et pålitelig verktøy å studere atferdsmessige effekten forårsaket av muterte proteiner i dopaminergic synapser3,4,7 og å være ansatt videresende genetisk skjermer for identifikasjon av romanen regulatoriske trasé involvert i DA signalering7,,8,,9,,10,,11,,12. I tillegg tilbyr en lett kvantifiserbare avlesning av narkotikainduserte atferd i levende dyr, SWIP gjør utviklingen av virkningsmekanismer av stoffer som amfetamin (AMFOTÆR) og azaperone på dopaminergic synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokoller for å utføre SWIP analyser har blitt beskrevet før16. Her beskrive vi i detalj metoder og installasjonsprogrammet til å utføre analysen med mål om å gi en visuell guide for C. elegans samfunnet å utføre SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en trinnvis protokoll for å utføre en opptreden analyse, SWIP, i C. elegans. Denne protokollen er enkel og grei med ingen store tekniske hekk gjør denne analysen meget bruker vennlig. Det er imidlertid noen viktige aspekter som må vurderes for å utføre analysen.
Omsorg bør tas for å sikre at ormer brukes for analysen er frisk matet, siden kosttilskudd restriksjon påvirker SWIP17. Forsiktig håndtering av ormer mens plukke godt timet na…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Osama Refai fra Dr. Randy Blakely lab for veiledning med automatisk analyse av SWIP. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra NIH R01 DA042156 til LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
