Плавательный паралич индуцированных для оценки допамина сигнализации в Caenorhabditis elegans
Summary
Плавательный вызванных паралич (SWIP) является устоявшейся поведенческих пробирного используется для изучения основных механизмов допамина сигнализации в Caenorhabditis elegans (C. elegans). Однако отсутствует подробный метод для выполнения анализа. Здесь мы опишем пошаговое протокол для SWIP.
Abstract
Плавательный assay, указанных в настоящем Протоколе является действенным инструментом для определения белков, регулирующих дофаминергические синапсы. Подобно млекопитающих, допамин (DA) контролирует несколько функций в C. elegans , включая обучение и двигательной активности. Условия, стимулировать да выпуска (например, амфетамин (AMPH) лечения) или что предотвратить да Распродажа (например, животных, не хватает да транспортера (dat-1) которые неспособны reaccumulating Да в нейроны) генерировать избыток внеклеточного да в конечном итоге приводит в стабилизированном опорно. Это поведение особенно очевидна, когда животные плавать в воде. В самом деле хотя одичал тип животных по-прежнему плавать в течение длительного периода, dat-1 null мутантов и одичал тип относились с AMPH или ингибиторы да транспортера опускаться на дно колодца и не двигаться. Это поведение называется «Паралич индуцированных плавательный» (SWIP). Хотя SWIP assay устоявшейся, отсутствует подробное описание метода. Здесь мы опишем пошаговое руководство для выполнения SWIP. Для выполнения анализа, конце личиночной стадии-4 животных помещаются в стеклянной пластины пятно, содержащий решение управления сахарозы с или без AMPH. За их поведение плавательный, либо вручную путем визуализации под стереоскоп автоматически записи с камеры смонтированы на стереоскоп забил животных. Видео затем анализируются с помощью отслеживания программного обеспечения, которое дает визуальное представление обмолота частоты и паралич в виде тепловых карт. Ручной и автоматизированной системы гарантируют легко количественной индикации животных плавательный способности и тем самым облегчить скрининга для животных, принимая мутации в системе дофаминергической или вспомогательные генов. Кроме того SWIP может использоваться для выяснения механизма действия наркотиков например AMPH.
Introduction
Животные выполняют разнообразные врожденные и сложных поведений посредничестве различных нейромедиаторов, координируется замысловатые сигнальных процессов. Нейротрансмиттеров допамина (DA) опосредует высоко сохранены поведения различных видов, включая обучение, моторики и вознаграждение обработки.
Почвы нематоду C. elegans, с относительно простой и хорошо сопоставленных нервной системы, состоящей из всего 302 нейронов, показывает заметно сложного поведения, включая многие, которые регулируются да как спаривания, обучение, нагула, передвижения и откладки 1. среди других особенностей, короткий жизненный цикл, простота обработки и сохранения сигнальных молекул, выделить преимущества использования C. elegans как модель для изучения нейронной основе сохранившихся поведения.
Гермафродит C. elegans содержит восемь дофаминергических нейронов; Кроме того самец содержит шесть дополнительных пар для спаривания целей. Как и млекопитающие эти нейроны синтезировать да и выразить да транспортера (DAT-1), мембранный белок, найдены исключительно в дофаминергических нейронов, который перевозит Да, выпущенный в синаптическую щель обратно в дофаминергических нейронов. Кроме того большинство белков, участвующих в каждом шаге синтеза, упаковки и выпуск да высоко консервируют между червями и людей, и, как у млекопитающих, да модулирует кормления поведения и передвижения в C. elegans2.
C. elegans ползет на твердых поверхностях и плавает с характерным обмолота поведением в воде. Интересно, что мутанты, отсутствует выражение DAT-1 (dat-1) обхода обычно на твердой поверхности, но не для поддержания плавательный при погружении в воду. Это поведение был назван индуцированных плавательный паралич, или SWIP. Предыдущие эксперименты показали, что SWIP, частично вызваны избытком Да в синаптическую щель, что в конечном итоге overstimulates D2-как постсинаптических рецепторов (DOP-3). Хотя первоначально определенных в dat-1 нокаут животных3, SWIP наблюдается также в одичал тип животных, препаратами что блок деятельность DAT (например, имипрамин4) и/или побудить да выпуска (например, амфетамин,5). С другой стороны фармакологической или генетических манипуляций, предотвращения синтеза и выпуск да и блокирование DOP-3 рецепторов функция предотвращения SWIP6. Взятые вместе, эти уже опубликованных данных создали SWIP как надежный инструмент для изучения поведенческие эффекты, вызванные мутированными белков внутри дофаминергические синапсы3,4,7 и использоваться для Форвард генетических экраны для идентификации Роман регулирования пути, участвующие в DA сигнализации7,8,9,10,,1112. Кроме того путем предоставления легко количественной индикации лекарственно индуцированные поведения в живых животных, SWIP включает разъяснение механизмов действия наркотиков, как амфетамин (AMPH) и азаперон на дофаминергические синапсы5, 6 , 13 , 14 , 15.
Протоколы для выполнения анализов SWIP были описаны до16. Здесь мы подробно описать, методологии и программы установки для выполнения анализа с целью обеспечения визуального руководство для C. elegans сообщества эффективно выполнять SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для выполнения поведенческого анализа, SWIP, в C. elegans. Этот протокол является простым и ясным с без крупных технических препятствий, сделать очень пользователя этот assay дружественные. Тем не менее есть некоторые критические аспекты, которые необх?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Доктор Осама Refai от д-р Рэнди Blakely лаборатории для руководства с автоматизированного анализа SWIP. Эта работа была поддержана финансирование из низ R01 DA042156 LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
