Simning inducerad förlamning att bedöma dopamin signalering i Caenorhabditis elegans
Summary
Simning inducerad förlamning (SWIP) är en väletablerad beteendevetenskaplig analys används för att studera bakomliggande mekanismer av dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Dock saknas en detaljerad metod för att utföra analysen. Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för SWIP.
Abstract
Den simning-analysen som beskrivs i detta protokoll är ett giltigt verktyg för att identifiera proteiner som reglerar dopaminerga synapser. Liknar däggdjur, dopamin (DA) styr flera funktioner i C. elegans inklusive lärande och motorisk aktivitet. Villkor som stimulerar DA release (t.ex. amfetamin (AMPH) behandlingar) eller att hindra DA clearance (t.ex. djur saknar DA transportören (dat-1) som är oförmögna att reaccumulating DA in i nervceller) generera ett överskott av extracellulära DA i slutändan leder till hämmad locomotion. Detta är särskilt tydligt när djur simma i vatten. I själva verket medan vildtyp djur fortsätter att simma under en längre period, dat-1 null mutanter och vildtyp behandlas med AMPH eller hämmare av DA transportören sjunka till botten av brunnen och inte flytta. Detta beteende kallas ”simning inducerad förlamning” (SWIP). Även om SWIP analysen är väl etablerad, saknas en detaljerad beskrivning av metoden. Här beskriver vi en steg för steg guide för att utföra SWIP. För att utföra analysen, placerats sena larval arrangerar-4 djuren i en spot glasplatta som innehåller kontroll sackaroslösning med eller utan AMPH. Djur är gjorde för deras simning beteende antingen manuellt eller genom visualisering under ett Stereoskop automatiskt genom inspelning med en kamera monterad på Stereoskop. Videor analyseras sedan med en spårningsprogramvara, som ger en visuell representation av thrashing frekvens och förlamning i form av värmekartor. Både manuella och automatiserade system garanterar en enkelt mätbara avläsning av djurens simkunnighet och därmed underlätta screening för djur som försetts med mutationer inom det dopaminerga systemet eller extra gener. SWIP kan dessutom användas för att belysa verkningsmekanismen av missbruksdroger såsom AMPH.
Introduction
Djur utför en mängd medfödda och komplexa beteenden som förmedlas av olika signalsubstanser samordnas av intrikata signalering processer. Signalsubstansen dopamin (DA) förmedlar mycket beteenden mellan arter, learning, motorik och belöning bearbetning.
Jord Nematoden C. elegans, med en relativt enkel och väl mappad nervsystemet som består av endast 302 nervceller, visar markant komplexa beteenden, inklusive många som regleras av DA såsom parning, lärande, födosökande, locomotion och äggläggning 1. bland andra funktioner, kort livslängd, enkel hantering och bevarande av signalmolekyler, lyfta fram fördelarna med att använda C. elegans som en modell för att studera personlighetens grund i bevarade beteenden.
Hermafroditt C. elegans innehåller åtta dopaminerga neuroner; Utöver dessa innehåller manlign sex extra par för parning ändamål. Precis som däggdjur, dessa nervceller syntetisera DA och express DA transportören (DAT-1), ett membranprotein som hittade uteslutande i dopaminerga neuron, som transporterar DA släppt i den synaptiska spalten tillbaka till dopaminerga nervceller. Dessutom de flesta av proteinerna som är involverade i varje steg i syntesen, förpackningar och frisättning av DA bevaras mycket mellan maskar och människor och som hos däggdjur, DA modulerar utfodring beteenden och förflyttning i C. elegans2.
C. elegans kryper på fasta ytor och simmar med en karakteristisk thrashing beteende i vatten. Intressant, mutanter saknas uttryck för DAT-1 (dat-1) krypa normalt på fast yta men misslyckas med att upprätthålla simning när nedsänkt i vatten. Detta beteende kallades simning inducerad förlamning eller SWIP. Tidigare experiment visat att SWIP, delvis orsakas av ett överskott av DA i den synaptiska spalten som slutligen overstimulates D2-liknande postsynaptiska receptorer (DOP-3). Även om ursprungligen identifierat i dat-1 knockout djur3, SWIP är också observerats i vilda djur som behandlats med läkemedel som blockerar aktiviteten av DAT (t.ex. imipramin4) och/eller inducera DA release (t.ex. amfetamin5). Däremot, hindra farmakologisk eller genetiska manipulationer avvärja syntes och frisättning av DA och blockering DOP-3 receptor funktion SWIP6. Sammantaget har dessa redan publicerade data etablerat SWIP som ett pålitligt verktyg att studera de beteendemässiga effekter som orsakas av muterade proteiner inom dopaminerga synapser3,4,7 och anställas för framåt genetiska skärmar för identifiering av nya rättsliga vägar inblandade i DA signalering7,8,9,10,11,12. Dessutom, genom att tillhandahålla ett enkelt mätbara avläsning av läkemedelsinducerad beteende i levande djur, SWIP möjliggör förtydligandet av verkningsmekanismer av droger som amfetamin (AMPH) och azaperon på dopaminerga synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokoll för att utföra SWIP analyserna har beskrivits före16. Här, beskriver vi i detalj metodik och setup för att utföra analysen med målet att ge en visuell guide för C. elegans gemenskapen att effektivt utföra SWIP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för att utföra en beteendevetenskaplig analys, SWIP, i C. elegans. Detta protokoll är enkel och okomplicerad med inga större tekniska hinder att göra denna analys mycket användarvänlig. Det finns dock några viktiga aspekter som måste beaktas för att effektivt utföra analysen.
Försiktighet bör iakttas så att de maskar som används för analysen är välgödd, eftersom dietrestriktioner påverkar SWIP17. Skon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Osama Refai från Dr Randy Blakely’s lab för vägledning med automatiserad analys av SWIP. Detta arbete stöds av medel från NIH R01 DA042156 till LC.
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
