乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション
Summary
マウス乳腺から開発されたオルガノイドを照射し、上皮形質および免疫細胞との相互作用を評価することを特徴とした。照射されたオルガノイドは、照射正常組織における腫瘍細胞動員につながる可能性のある細胞間相互作用をよりよく評価するために使用することができる。
Abstract
消化された組織に由来するオルガノイドは、多細胞三次元 (3D) 構成要素であり、細胞単層よりもインビボ条件においてより良い不在を有する。これらは、生体内の複雑さを完全にモデル化できませんが、元の臓器のいくつかの機能を保持します。がんモデルでは、オルガノイドは、腫瘍細胞の浸潤を研究するために一般的に使用されます。このプロトコルは正常な、照射されたマウス乳腺組織からのオルガノイドを発達させることを特徴とし、正常組織における放射線応答を評価することを目的とする。これらのオルガノイドは、放射線照射されたオルガノイドとの腫瘍細胞相互作用を評価するために将来のインビトロ癌研究に適用することができる。乳腺を切除し、20 Gy に照射し、コラゲナーゼ VIII 溶液で消化した。上皮のオルガノイドは遠心分化によって分離され、3D オルガノイドは96の低付着性マイクロプレートで開発しました。オルガノイドは、特徴的な上皮マーカーサイトケラチン14を発現した。オルガノイドとのマクロファージ相互作用は、共培養実験で観察された。このモデルは、腫瘍間質相互作用、免疫細胞の浸潤、および照射された微小環境内のマクロファージ偏波を研究するのに有用である可能性がある。
Introduction
3つの否定的な乳癌 (TNBC) の患者のおよそ 60% は処置1の形態として乳房温存療法 (BCT) を選ぶ。この治療モダリティでは、乳房組織の一部を含む腫瘍を除去し、周囲の正常組織を電離放射線に曝露して、任意の残留腫瘍細胞を死滅させる。治療は、乳癌集団の多くで再発を減少させます;しかし、TNBC 経験を持つ治療された患者の約 13.5% が2を再発局所領域的。したがって、放射線がどのように循環腫瘍細胞 (CTCs) を募集するかを研究することは、局所再発3,4における重要な洞察につながります。
従来の研究は、正常組織の放射線が様々な細胞型5の動員を増加させることを示している。TNBC の前臨床モデルにおいて、正常組織の照射はマクロファージを増加させ、続いて正常組織5に腫瘍細胞を動員する。免疫状態は、照射部位への腫瘍細胞の動員に影響を与え、腫瘍細胞の遊走は免疫不全の被験者で観察された。乳腺に由来するオルガノイドを用いてこれらの相互作用を概説することで、細胞遊走と細胞間相互作用を顕微鏡検査と生細胞イメージングでリアルタイムに観察し、変化による放射線損傷の役割を決定することができます。腫瘍細胞の挙動。
マウス乳腺オルガノイドは、乳腺の発達における主要なステップを解明するのに役立った。乳腺オルガノイドは50μ m6,7,8,9,10よりも大きい単離された乳腺上皮の多細胞性、三次元構造体である。原発性上皮オルガノイドを用いて、サル et al. は、乳腺7における分枝について必要な因子を評価した。シャミル et al. は上皮間葉転移を伴わない伝播が起こり得ることを発見し、転移性カスケード8に対する洞察を提供する。乳腺組織からのオルガノイドの生成および特徴づけの方法は、6、11、12、13で十分に確立されている。しかし、我々の知る限りでは、乳腺から照射されたオルガノイドが増殖するための方法は報告していない。照射されたオルガノイドの増殖および特性評価のためのプロトコルは、放射線誘導免疫および腫瘍細胞の概説において重要なステップである。
本論文では、スフェロイドの形成をサポートする親水性高分子を被覆した低接着マイクロプレートにおいて、照射された乳腺上皮オルガノイドを増殖・特性評価する方法を報告する。これらのオルガノイドは、免疫細胞浸潤動態を調べるためにマクロファージと共培養した。この作業は、脂肪細胞との共培養オルガノイドを乳房特性に不在し、腫瘍細胞の動員を可視化する乳癌細胞、および CD8 + T 細胞が腫瘍・免疫細胞相互作用を研究するように拡張することができる。以前に確立されたプロトコルは、照射オルガノイドを評価するために使用することができる。以前のモデルでは、乳腺オルガノイドと免疫細胞の共培養は、転移と播種のメカニズムに光を当てています。DeNardo et al. は、腫瘍関連マクロファージの CD4 + T 細胞調節が乳腺腺癌14の転移性表現型を増強したことを見出した。共培養モデルは、生物学的発達のメカニズムを解明するためにも用いられてきた。Plaks et al. は、乳腺器官形成15のダウンレギュレータとしての CD4 + T 細胞の役割を明らかにした。しかし、私たちのグループは、正常な組織の照射がどのように免疫細胞の挙動に影響するかを可視化する手順を最初に確立します。正常な組織の照射が腫瘍細胞の動員5を増強することが示されているので、このプロトコルは、腫瘍細胞の挙動が正常な組織および細胞の照射によってどのように変化するかを分析するためにさらに開発することができ、より大きな理解につながる癌の再発
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、照射された乳腺オルガノイドの再生可能な成長と特性評価のための方法を開発しました (図 1)。20 Gy の照射用量を、腫瘍細胞リクルート5の前インビボモデルを鏡映するために適用した。オルガノイド形成の前にインビボの乳腺の照射は、免疫細胞の対応する浸潤を伴わずに放射線損傷の影響を単離することを可能にした。インビ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、GFP と dTomato 標識の生264.7 マクロファージを提供するために、Dr. ローラ l. Bronsart に感謝します。本研究は、NIH 助成 #R00CA201304 による財政的支援であった。
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
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