유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화
Summary
마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.
Abstract
소화 조직 으로부터 유래 된 오 르가 노이 드는 세포 단층 보다 생체 내 조건에서 더 잘 탈환 되는 다중 세포 3 차원 (3d) 구조 이다. 비록 그들은 완전히 생체의 복잡성을 모델링할 수 없습니다., 그들은 원래 장기의 일부 기능을 유지. 암 모델에서, 오 르가 노이 드는 일반적으로 종양 세포의 침략을 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 정상 조직에서 방사선 반응을 평가 하기 위해 정상 및 조사 된 마우스 유선 조직에서 유기 체를 개발 하 고 특성화 하는 것을 목표로 합니다. 이러한 유기 oid는 방사선 조사 된 소기관과의 종양 세포 상호작용을 평가 하기 위해 미래의 시험관 내 암 연구에 적용 될 수 있다. 유 방 땀 샘은 절제 되었고, 20 Gy에 조사 되었으며, 콜라 게 나아 제 VIII 용액으로 소화 되었습니다. 상피 소기관은 원심 분화를 통해 분리 되었고, 3 차원 유기 체는 96-잘 저 접착 마이크로 플레이트에서 개발 되었다. 유기 oid는 특징적인 상피 마커 사이토 케 라틴 (14)을 발현 시켰다. 대 식 세포와 소기관 간의 상호작용은 공동 배양 실험에서 관찰 되었다. 이 모형은 종양 간 질 상호 작용, 면역 세포의 침 윤 및 조사 된 미세 환경 내에서의 대 식 세포 분극을 연구 하는 데 유용할 수 있습니다.
Introduction
삼중 음성 유방암 (TNBC)의 약 60% 환자는 치료1의 한 형태로 서 유 방 보존 요법 (bct)을 선택 한다. 이러한 치료 양상에서, 유 방 조직의 일부를 포함 하는 종양은 제거 되 고, 주변 정상 조직은 잔류 종양 세포를 죽이기 위해 이온화 방사선에 노출 된다. 치료는 유방암 인구의 다량에 있는 재발을 감소 시킵니다; 그러나 TNBC를 사용한 치료 대상 환자의 약 13.5%가 locoregional 재발2를 경험 한다. 따라서, 방사선은 순환 종양 세포를 모집 할 수 있는 방법을 연구 (ctcs) 로컬 재발에 대 한 중요 한 통찰력으로 이어질 것입니다3,4.
이전 작업에서는 정상 조직의 방사선이 다양 한 세포 유형5의 모집을 증가 시킨다는 것을 보여주었습니다. TNBC의 전 임상 모델에서 정상 조직에 대 한 대 식 세포 증가 및 후속 적 종양 세포의 조사는 정상 조직5에 관한 것 이다. 면역 상태는 조사 된 사이트에 종양 세포 모집에 영향을 미쳤다, 종양 세포 이동은 면역 손상 된 과목에서 관찰. 유 방 땀 샘에서 파생 된 오 르가 노이 드를 사용 하 여 이러한 상호 작용은 현미경 및 살아있는 세포 이미징을 통해 실시간으로 세포 이동 및 세포 간 질 상호 작용을 관찰 하 여 변경 시 방사선 손상의 역할을 결정할 수 있습니다. 종양 세포 행동.
마우스 유 방 소기관은 유선의 발달에서 주요 단계를 명료 하 게 도왔습니다. 유 방 소기관은 50 μm6,7,9,10보다 큰 고립 된 유 방 상피의 다중 세포, 3 차원 구조입니다. 1 차적인 상피 소기관을 사용 하 여, 시 미안 외. 유선에서 분기에 필요한 요인을 평가7. 샤미르 외. 확산은 중간 엽 전이에 상피 없이 발생할 수 있음을 발견, 전이성 캐스케이드에 대 한 통찰력을 제공8. 유선 조직 으로부터 유기 oid를 생성 하 고 특성화 하는 방법은 잘 확립 되어 있다6,11,12,13. 그러나, 우리의 지식에, 유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체를 성장 시키는 방법은 보고 되지 않았습니다. 조사 된 오 르가 노이 드의 성장 및 특성화를 위한 프로토콜은 방사선-유도 면역 및 종양 세포 모집을 탈환 하는 중요 한 단계 일 것 이다.
이 논문에서, 우리는 구상 된 유 방 상피 소기관의 성장 및 특성화를 위한 방법을 보고 하며,이는 구형 oid의 형성을 지 원하는 친수성 고분자로 코팅 된 저 밀착 마이크로 플레이트입니다. 이들 유기 체는 면역 세포 침투 동역학을 조사 하기 위해 대 식 세포와 공동 배양 하였다. 이 작업은 종양-면역 세포 상호 작용을 연구 하기 위해 종양 세포 모집 및 CD8 + T 세포를 가시화 하기 위해 유 방 특성, 유방암 세포를 다시 캡처하는 지방 세포와의 공동 배양을 포함 하도록 확장 될 수 있다. 이전에 확립 된 프로토콜은 조사 된 유기 체를 평가 하는데 사용 될 수 있다. 이전 모델은 유 방 소기관 및 면역 세포를 공동 배양 하 여 전이 및 보급 메커니즘에 빛을 발산 했습니다. DeNardo et al. 종양 관련 대 식 세포의 CD4 + T 세포 규제가 유 방 암 종의 전이성 표현 형을 향상시켰다는 것을 발견 하였다. 공동 배양 모델은 또한 생물학적 개발의 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 사용 되었습니다. Plaks et al. 유선의 다운 조정기로 서 CD4 + T 세포의 역할을 명확히 했다15. 그러나, 우리 그룹은 정상 조직 조사가 면역 세포 행동에 미치는 영향을 시각화 하는 절차를 확립 하는 첫 번째입니다. 정상 조직 조사는 종양 세포 모집5를 강화 하는 것으로 나타났습니다 때문에,이 프로토콜은 종양 세포 행동이 정상 조직과 세포의 조사에 의해 변경 되는 방법을 분석 하기 위해 추가로 개발 될 수 있기 때문에, 더 큰 이해를 선도 암 재발.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 조사 된 유 방 유기 체의 성장 및 특성화를 재현 하기 위한 방법을 개발 했습니다 (그림 1). 20gy의 조사 량은 종양 세포 모집5의 생체 내 모델 이전에 거울에 적용 되었다. 유 방 땀 샘의 조사는 생체 내 형성 이전에 면역 세포의 상응 하는 침 윤 없이 방사선 손상 효과의 분리를 허용 하였다. 시험관 내 조사 된 정상 조직 모델의 개발?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 GFP와 dTomato 표지 된 원시 264.7 대 식 세포를 제공 하는 닥터로 라 l. 브 론 사르 감사 합니다. 이 연구는 재정적으로 NIH 그랜트 #R00CA201304에 의해 지원 되었다.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
Referências
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Pesquisa do Câncer. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Bioquímica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
