Identifier les surproducteurs d'acides aminés à l'aide de marqueurs rares-codon-riches
Summary
Cette étude présente une stratégie alternative à la méthode analogique toxique conventionnelle en identifiant les surproducteurs d’acides aminés en utilisant des marqueurs rares-codon-riches pour atteindre la précision, la sensibilité, et le haut débit simultanément.
Abstract
Pour satisfaire le marché toujours croissant des acides aminés, des souches de production de haute performance sont nécessaires. Les surproducteurs d’acides aminés sont identifiés de façon conventionnelle en exploitant les compétitions entre les acides aminés et leurs analogues. Cependant, cette méthode à base analogique est de faible précision, et les analogues appropriés pour les acides aminés spécifiques sont limités. Ici, nous présentons une stratégie alternative qui permet un criblage précis, sensible, et à haut débit des surproducteurs d’acide aminé utilisant des marqueurs rares-codon-riches. Cette stratégie s’inspire du phénomène du biais d’utilisation du codon dans la traduction des protéines, pour lequel les codons sont classés en codons communs ou rares en fonction de leurs fréquences d’occurrence dans l’ADN codant. La traduction des codons rares dépend de leur ARN de transfert rare correspondant (TRNAs), qui ne peuvent pas être entièrement chargés par les acides aminés cognés sous la famine. Théoriquement, les ARNt rares peuvent être facturés s’il y a un surplus des acides aminés après avoir chargé les isoaccepteurs communs synonymes. Par conséquent, les traductions retardées causées par des codons rares pourraient être restaurées par l’alimentation ou la surproduction intracellulaire des acides aminés correspondants. Selon cette hypothèse, un système de sélection ou de dépistage pour identifier les surproducteurs d’acides aminés est établi en remplaçant les codons communs des acides aminés ciblés par leurs alternatives rares synonymes dans les gènes de résistance aux antibiotiques ou les gènes codage des protéines fluorescentes ou chromogéniques. Nous montrons que les expressions protéiques peuvent être grandement entravées par l’incorporation de codons rares et que les niveaux de protéines sont en corrélation positive avec les concentrations d’acides aminés. Grâce à ce système, les surproducteurs d’acides aminés multiples peuvent être facilement éliminés des bibliothèques de mutation. Cette stratégie à base de codon rare ne nécessite qu’un seul gène modifié, et l’hôte est moins susceptible d’échapper à la sélection que dans d’autres méthodes. Il offre une approche alternative pour obtenir des surproducteurs d’acides aminés.
Introduction
La production actuelle d’acides aminés repose fortement sur la fermentation. Cependant, les titers et les rendements de la plupart des souches de production d’acides aminés sont inférieurs à la demande croissante du marché mondial des acides aminés qui vaut des milliards de dollars1,2. L’obtention de surproducteurs d’acides aminés de haute performance est essentielle à la mise à niveau de l’industrie des acides aminés.
La stratégie traditionnelle pour identifier les surproducteurs d’acides aminés exploite les compétitions entre les acides aminés et leurs analogues dans la synthèse des protéines3,4. Ces analogues sont capables de charger les ARNt qui reconnaissent les acides aminés correspondants et inhibent ainsi les allongements des chaînes peptidiques, conduisant à la croissance arrêtée ou la mort cellulaire5. Une façon de résister aux contraintes analogiques est d’augmenter les concentrations d’acides aminés intracellulaires. Les acides aminés enrichis surpasseront les analogues pour les tARN finis et assureront la synthèse correcte des protéines fonctionnelles. Par conséquent, les souches qui survivent aux analogues peuvent être sélectionnées et sont probablement les surproducteurs des acides aminés correspondants.
Bien qu’elle ait réussi à sélectionner des surproducteurs pour des acides aminés tels que l’alucine6, la stratégie analogique souffre de graves inconvénients. Une préoccupation majeure est la résistance analogique provenant du processus de mutagénèse ou par des mutations spontanées. Les souches avec résistance peuvent échapper à la sélection en bloquant, en exportant ou en dégradant les analogues5. Une autre préoccupation est les effets secondaires toxiques des analogues sur d’autres processus cellulaires7. En conséquence, les souches qui survivent à la sélection analogique peuvent ne pas être les surproducteurs d’acides aminés, tandis que les surproducteurs désirés pourraient être faussement exterminés en raison des effets secondaires négatifs.
Ici, une nouvelle stratégie basée sur la loi du biais de codon est présentée afin d’obtenir des identifications précises et rapides des surproducteurs d’acides aminés. La plupart des acides aminés sont codés par plus d’un triplet nucléotide qui est favorisé différemment par les organismes hôtes8,9. Certains codons sont rarement utilisés dans les séquences de codage et sont appelés les codons rares. Leurs traductions en acides aminés s’appuient sur les tARN cognate qui portent les acides aminés correspondants. Cependant, les ARTN qui reconnaissent les codons rares ont généralement des abondances beaucoup plus faibles que les ARNt des codons communs10,11. Par conséquent, ces ARN rares sont moins susceptibles de capturer les acides aminés libres dans les compétitions avec d’autres isoacceptateurs, et les traductions des séquences rares-codon-riches commencent à décélérer ou même sont terminées lorsque les quantités d’acides aminés sont limitées 10. Les traductions pourraient, théoriquement, être restaurées s’il y a un excédent d’acide aminé après avoir chargé les ARTN communes synonymes en raison de surproductions ou d’alimentations supplémentaires des acides aminés correspondants12. Si le gène rare-codon-riche code un marqueur de sélection ou de criblage, les souches présentant les phénotypes correspondants peuvent alors être facilement identifiées et sont probablement les surproducteurs des acides aminés visés.
La stratégie ci-dessus est appliquée pour établir une sélection et un système de dépistage pour l’identification des surproducteurs d’acides aminés. Le système de sélection utilise des gènes de résistance aux antibiotiques (p. ex., kanR) comme marqueurs tandis que le système de dépistage utilise les gènes codant les protéines fluorescentes vertes (p. ex. protéines fluorescentes vertes [GFP]) ou chromogéniques (p. ex., PrancerPurple). Les gènes marqueurs dans les deux systèmes sont modifiés en remplaçant les nombres définis des codons communs pour l’acide aminé ciblé avec son alternative rare synonyme. Les souches de la bibliothèque de mutation qui abritent le gène marqueur rare-codon-riche sont sélectionnées ou examinées dans des conditions appropriées, et les surproducteurs des acides aminés ciblés peuvent être facilement identifiés. Le flux de travail commence par la construction du système génétique marqueur rare-codon-riche, suivi par l’optimisation des conditions de travail, puis l’identification et la vérification des surproducteurs d’acide aminé. Cette stratégie analogue-indépendante est basée sur le dogme dans la traduction de protéine et a été pratiquement vérifiée pour permettre l’identification précise et rapide des surproducteurs d’acide aminé. Théoriquement, il pourrait être directement utilisé pour les acides aminés avec des codons rares et à tous les micro-organismes. Dans l’ensemble, la stratégie basée sur le codon rare servira de solution de rechange efficace à l’approche analogique conventionnelle lorsque les analogues appropriés pour des acides aminés spécifiques ne sont pas disponibles, ou lorsqu’un taux de faux positifs élevé est la principale préoccupation. Le protocole ci-dessous utilise le codon rare de leucine pour démontrer cette stratégie en identifiant les surproducteurs de L-leucine d’Escherichia coli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le nombre de codons rares dans les gènes marqueurs et le milieu de sélection ou de dépistage sont essentiels pour inhiber les expressions protéiques des gènes marqueurs modifiés par le codon rare. Si aucune différence significative ne peut être détectée entre les expressions protéiques des gènes marqueurs de type sauvage et leurs dérivés, l’augmentation du nombre de codons rares ou l’utilisation d’un milieu à teneur en nutriments peut amplifier les différences. Cependant, si l’effet d’inhibition est trop …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus conjointement par la National Natural Science Foundation of China (subvention no 21676026), le National Key R-D Program of China (grant no 2017YFD0201400) et la China Postdoctoral Science Foundation (subvention no 2017M620643). Les travaux de l’UCLA Institute of Advancement (Suzhou) ont été soutenus par les subventions internes de la province du Jiangsu et du parc industriel de Suzhou.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
Referências
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