Identifizieren von Aminosäure-Overproduzenten mit selten-Codon-reichen Markern
Summary
Diese Studie präsentiert eine alternative Strategie zur herkömmlichen toxischen analogen Methode zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten durch verwendung seltener Kodon-reicher Marker, um Genauigkeit, Empfindlichkeit und hohen Durchsatz gleichzeitig zu erreichen.
Abstract
Um den ständig wachsenden Markt für Aminosäuren zu befriedigen, werden Hochleistungs-Produktionsstämme benötigt. Die Aminosäure-Overproduzenten werden konventionell identifiziert, indem sie die Wettbewerbe zwischen Aminosäuren und ihren Analoga nutzen. Diese analoge Methode ist jedoch von geringer Genauigkeit, und richtige Analoga für bestimmte Aminosäuren sind begrenzt. Hier stellen wir eine alternative Strategie vor, die ein genaues, sensibles und hochdurchsatzreiches Screening von Aminosäureüberproduzenten mit selten-kodonreichen Markern ermöglicht. Diese Strategie ist inspiriert von dem Phänomen der Kodonverwendungsverzerrung in der Proteintranslation, für das Codons in häufige oder seltene basierend auf ihren Häufigkeiten des Auftretens in der kodierenden DNA kategorisiert werden. Die Übersetzung seltener Codons hängt von ihren entsprechenden seltenen Transfer-RNAs (tRNAs) ab, die von den cognate-Aminosäuren unter Hunger nicht vollständig aufgeladen werden können. Theoretisch können die seltenen tRNAs aufgeladen werden, wenn es einen Überschuss der Aminosäuren nach dem Aufladen der synonymen gemeinsamen Isoaktoren gibt. Daher könnten verzögerte Übersetzungen, die durch seltene Codons verursacht werden, durch Fütterung oder intrazelluläre Überproduktion der entsprechenden Aminosäuren wiederhergestellt werden. Unter dieser Annahme wird ein Selektions- oder Screening-System zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten eingerichtet, indem die gemeinsamen Kodone der zielgerichteten Aminosäuren durch ihre synonymen seltenen Alternativen in den Antibiotikaresistenzgenen oder den Genen ersetzt werden. fluoreszierende oder chromogene Proteine. Wir zeigen, dass die Proteinausdrücke durch die Aufnahme seltener Codons stark behindert werden können und dass die Proteine positiv mit den Aminosäurekonzentrationen korrelieren. Mit diesem System können Überproduzenten mehrerer Aminosäuren leicht aus Mutationsbibliotheken abgeschirmt werden. Diese auf seltenen Kodonen basierende Strategie erfordert nur ein einzelnes modifiziertes Gen, und der Wirt ist weniger wahrscheinlich, der Auswahl zu entgehen als bei anderen Methoden. Es bietet einen alternativen Ansatz für die Gewinnung von Aminosäure-Overproduzenten.
Introduction
Die aktuelle Produktion von Aminosäuren hängt stark von der Fermentation ab. Allerdings liegen die Titer und Erträge für die meisten Aminosäurenproduktionsstämme unter den steigenden Anforderungen des globalen Aminosäuremarktes, der Milliarden von Dollar wert ist1,2. Die Gewinnung von Hochleistungs-Aminosäure-Overproduzenten sind entscheidend für die Aufwertung der Aminosäureindustrie.
Traditionelle Strategie zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten nutzt die Wettbewerbe zwischen Aminosäuren und ihren Analoga in der Proteinsynthese3,4. Diese Analoga sind in der Lage, die tRNAs aufzuladen, die die entsprechenden Aminosäuren erkennen und so die Dehnungen der Peptidketten hemmen, was zu festem Wachstum oder Zelltodführt 5. Eine Möglichkeit, den analogen Spannungen zu widerstehen, besteht darin, die Konzentrationen von intrazellulären Aminosäuren zu erhöhen. Die angereicherten Aminosäuren übertreffen die Analoga für die endlichen tRNAs und sorgen für die korrekte Synthese funktioneller Proteine. Daher können Stämme, die die Analoga überleben, ausgewählt werden und sind wahrscheinlich die Überproduzenten der entsprechenden Aminosäuren.
Obwohl sich bei der Auswahl von Überproduzenten für Aminosäuren wie L-Leucin6als erfolgreich erwiesen hat, leidet die analoge Strategie unter gravierenden Nachteilen. Ein Hauptanliegen ist der analoge Widerstand, der aus dem Prozess der Mutagenese oder durch spontane Mutationen entstanden ist. Stämme mit Widerstand können der Auswahl entkommen, indem sie die Analoga5blockieren, exportieren oder herabstufen. Ein weiteres Problem sind die toxischen Nebenwirkungen der Analoga auf andere zelluläre Prozesse7. Infolgedessen können Stämme, die die analoge Selektion überleben, nicht die Aminosäure-Overproduzenten sein, während die gewünschten Overproduzenten aufgrund der negativen Nebenwirkungen fälschlicherweise ausgerottet werden könnten.
Hier wird eine neuartige Strategie vorgestellt, die auf dem Gesetz der Kodonvoreingenommenheit basiert, um genaue und schnelle Identifizierungen von Aminosäureüberproduzenten zu erreichen. Die meisten Aminosäuren werden durch mehr als ein Nukleotid-Triplet kodiert, das von den Wirtsorganismen anders bevorzugt wird8,9. Einige Codons werden selten in den Codierungssequenzen verwendet und werden als die seltenen Codons bezeichnet. Ihre Übersetzungen in Aminosäuren basieren auf den cognate tRNAs, die die entsprechenden Aminosäuren tragen. Jedoch, die tRNAs, die seltene Codons erkennen, haben in der Regel viel geringere Überfluss als die tRNAs der gemeinsamen Codons10,11. Folglich sind diese seltenen tRNAs weniger wahrscheinlich, die freien Aminosäuren in den Wettbewerben mit anderen Isoaktoren zu erfassen, und Übersetzungen der selten-codonreichen Sequenzen beginnen zu verlangsamen oder werden sogar beendet, wenn die Mengen an Aminosäuren begrenzt sind. 10. Die Übersetzungen könnten theoretisch wiederhergestellt werden, wenn nach dem Aufladen der synonymen gemeinsamen tRNAs aufgrund von Überproduktionen oder Extra-Fütterungen der entsprechenden Aminosäuren12ein Aminosäureüberschuss vorliegt. Wenn das selten-kodonreiche Gen einen Selektions- oder Screening-Marker kodiert, können Stämme, die die entsprechenden Phänotypen aufweisen, leicht identifiziert werden und sind wahrscheinlich die Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren.
Die obige Strategie wird angewendet, um eine Auswahl und ein Screening-System zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten zu etablieren. Das Selektionssystem verwendet Antibiotikaresistenzgene (z. B. kanR) als Marker, während das Screening-System die Gene verwendet, die fluoreszierende (z. B. grünes fluoreszierendes Protein [GFP]) oder chromogene (z. B. PrancerPurple) Proteine kodieren. Die Markergene in beiden Systemen werden modifiziert, indem definierte Zahlen der gemeinsamen Codons für die zielgerichtete Aminosäure durch ihre synonyme seltene Alternative ersetzt werden. Stämme in der Mutationsbibliothek, die das selten-kodonreiche Markergen beherbergen, werden unter geeigneten Bedingungen ausgewählt oder gescreent, und die Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren können leicht identifiziert werden. Der Arbeitsablauf beginnt mit dem Aufbau des selten-kodonreichen Marker-Gensystems, gefolgt von der Optimierung der Arbeitsbedingungen und der Identifizierung und Verifizierung der Aminosäure-Überproduzenten. Diese analog-unabhängige Strategie basiert auf dem Dogma in der Proteintranslation und wurde praktisch verifiziert, um eine genaue und schnelle Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten zu ermöglichen. Theoretisch könnte es direkt an Aminosäuren mit seltenen Codons und an alle Mikroorganismen angewendet werden. Insgesamt wird die auf seltenen Kodonen basierende Strategie als effiziente Alternative zum herkömmlichen analogen Ansatz dienen, wenn geeignete Analoga für bestimmte Aminosäuren nicht verfügbar sind oder wenn eine hohe falsch positive Rate das Hauptanliegen ist. Das nachstehende Protokoll verwendet seltenes Leucin-Kodon, um diese Strategie bei der Identifizierung von Escherichia coli L-Leucin-Overproduzenten zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anzahl der seltenen Codons in den Markergenen und dem Selektions- oder Screeningmedium ist entscheidend, um Proteinausdrücke aus den selten-codonmodifizierten Markergenen zu hemmen. Wenn kein signifikanter Unterschied zwischen Proteinausdrücken aus den Wildtyp-Markergenen und ihren Derivaten nachgewiesen werden kann, kann die Erhöhung der Anzahl seltener Codons oder die Verwendung eines nährstoffbegrenzten Mediums die Unterschiede verstärken. Wenn die Hemmungswirkung jedoch zu stark ist, können die Proteinausdr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 21676026), dem National Key R&D Program of China (Grant-Nr. 2017YFD0201400) und der China Postdoctoral Science Foundation (Grant-Nr. 2017M620643) unterstützt. Die Arbeiten am UCLA Institute of Advancement (Suzhou) wurden durch interne Zuschüsse der Provinz Jiangsu und des Industrieparks Suzhou unterstützt.
Materials
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
Referências
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