Summary
Her beskriver vi udviklingen af en klinisk relevant murine model af leverkræft rekapitulere de typiske immun funktioner af hepatocellulær cancer (HCC).
Abstract
Fraværet af en klinisk relevant dyremodel, der adresserer de typiske immun karakteristika ved hepatocellulær cancer (HCC), har i væsentlig grad forhindret elucidationen af de underliggende mekanismer og udviklingen af innovative immunterapeutiske strategier. For at udvikle en ideel dyremodel til at rekapitulere Human HCC, immunkompetente mandlige C57BL/6J mus først modtage en Carbon tetrachlorid (CCl4) injektion for at fremkalde lever fibrose, derefter modtage histologisk-normale onkogene hepatocytter fra unge mandlige SV40 T antigen (TAg)-Transgene mus (MTD2) ved intra-splenisk (ISPL) inokulation. Androgen genereret i recipient mandlige mus i puberteten indleder TAg udtryk under kontrol af en lever-specifik promotor. Som et resultat, de overførte hepatocytter bliver kræftceller og danne tumor masser i fastsættelsen af lever fibrose/cirrhose. Denne nye model efterligner Human HCC initiering og progression i forbindelse med lever fibrose/cirrhose og afspejler de mest typiske træk ved humant HCC herunder immun dysfunktion.
Introduction
Hepatocellulær cancer (HCC) er den mest hastigt voksende type kræft i USA (US)1,2,3. Hvert år diagnosticeres ca. 850.000 nye tilfælde4,5 og 700.000 patienter dør af denne dødeligesygdom 6,7,8,9,10 , hvilket gør den til den næsthøjeste årsag til kræft relateret død verden over. Administration af HCC omfatter kirurgisk resektion, transplantation, ablation, chemoembolization eller systemiske terapier, såsom sorafenib11. Tidlig diagnose og administration med kirurgisk resektion eller transplantation har den højeste samlede overlevelsesfordel4. Desværre, de fleste patienter til stede på et senere tidspunkt og kræver administration med ablation, chemoembolization eller sorafenib12. Sorafenib, en receptor tyrosinkinasehæmmer (RTKI), blev godkendt af Food and Drug Administration i 2008 som den eneste systemiske lægemiddelbehandling, der var tilgængelig til behandling af inoperabel HCC. Selv om stoffet kun giver en beskeden stigning i den samlede overlevelse, fra 7,9 til 10,7 måneder13, det gav en ny terapeutisk strategi, der kunne udnyttes til at forvalte HCC.
Manipulation af immunsystemet for at eliminere etablerede kræftformer er et hastigt voksende felt inden for kræftforskning14. Immun check point studier har betydeligt avanceret immunotherapeutisk lægemiddeludvikling i kræftbehandling15,16. FDA godkendte brugen af antistoffer (ABS) mod cytotoksisk T-lymfocyt antigen 4 (CTLA-4), programmeret celledød protein 1 (PD-1) og dets ligand PD-L1 til behandling af melanom, lungekræft, hoved-og nakke kræft og blærecancer17, 18 , 19 , 20. kliniske forsøg med monoterapi eller kombinationsbehandling med et eller flere antistoffer mod PD-1, PD-L1 eller ctla-4 til behandling af avanceret HCC er i gang21,22,23og nogle forsøg har vist gunstige resultater. I 2017, FDA givet fremskyndet godkendelse for anti-PD-1 antistof til behandling af HCC patienter, der er resistens over for sorafenib, men den samlede responsrate af denne behandling er kun 14,3%. Andre strategier er ikke blevet oversat til klinisk praksis på dette tidspunkt24,25. Overvinde tumor-induceret dyb immuntolerance for at forbedre immun check point terapi26; forudsigelse af effekten af immun check point terapi; forebyggelse af immunrelaterede uønskede hændelser optimering af administrationsvej, dosering og hyppighed; og finde effektive kombinationer af terapier27,28,29 alle forbliver yderst udfordrende opgaver.
Der er flere konventionelle tilgange, der anvendes til at inducere HCC i musemodeller i øjeblikket og udnyttes afhængigt af investigators særlige forskning spørgsmål30. Kemisk inducerede HCC-musemodeller med genotoksiske forbindelser efterligner skade forårsagede maligniteter. Xenograft-modeller gennem enten ektopisk eller ortotopisk implantation af HCC-cellelinjer er velegnede til lægemiddel screening. En række genetisk modificerede mus er blevet konstrueret til at undersøge Patofysiologi af HCC. Transgene mus, der udtrykker virale gener, onkogener og/eller vækstfaktorer gør det muligt at identificere veje involveret i hepatocarcinogenese. På grund af iboende begrænsninger, kan disse modeller ikke rekapitulere de typiske immun karakteristika, der ses i human HCC, som har betydeligt hæmmet belysning af de underliggende mekanismer og udvikling af innovative immunotherapeutiske strategier14 ,15. Vi har for nylig skabt en klinisk relevant murine model. Denne roman model ikke kun efterligner Human HCC initiering og progression, men også afspejler de fleste typiske træk ved sygdomme hos mennesker, herunder immun dysfunktion. Vi har karakteriseret dets biologiske og immunologiske egenskaber. Ved at udnytte denne nye model har vi undersøgt forskellige immun terapeutiske strategier til behandling af HCC31,32,33,34,35,36, 37. denne unikke platform giver os mulighed for at studere mekanismer af tumor-induceret immunotolerance og udvikle proof-of-koncept terapeutiske strategier for HCC mod eventuel klinisk oversættelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: alle de procedurer, herunder dyr emner er blevet godkendt af IACUC på University of Missouri. Alle mus fik human behandling i henhold til de kriterier, som er skitseret i "vejledning i pleje og anvendelse af forsøgsdyr". Følgende procedure for celle isolering og inokulation bør udføres i en hætte. Alle udøvende kunstnere bør bære standard personlige værnemidler til håndtering af mus og væv.
1. induktion af lever fibrose og cirrhose med IP-injektion af Tetrachlorid (CCl4)
Bemærk: Se figur 1. (CCl4 er meget farligt reagens, bør det håndteres forsigtigt og med at bære kemikalieresistente handsker)
- Få mandlige C57BL/6J mus, der er seks til otte uger gamle (Se tabel over materialer).
- Forbered 10% CCl4 (v/v) opløsning i majsolie i et centrifugeglas. Bestem det totale volumenbaseret på antallet af mus, der skal injiceres (Se trin 1,6).
- Brug passende mus håndteringsteknik til at vælge en mus til injektion.
- Manuelt holde musen tilbage med sin dorsale (maven) side op.
- Rengør injektionsstedet på bugvæggen af musen ved at skrubbe med 70% alkohol.
- Injicer mandlige C57BL/6J mus med 160 μL 10% CCl4 opløsning ved intraperitoneal (IP) injektion ved hjælp af en 25-gauge engangskanyle.
- Sørg for, at nålen trænger lige gennem bugvæggen (ca. 4-5 mm) med facet side opad og lidt vinklet ved 15-20 grader.
- Indsprøjt mus to gange om ugen i alt fire uger-hver mus vil modtage i alt otte injektioner.
Bemærk: to uger efter den sidste injektion er de behandlede mus klar til ISPL-inokulering af onkogene hepatocytter fra MTD2-mus.
2. isolerende tag-transgene hepatocytter fra line MTD2 mus
Bemærk: Se tabel 1 for løsnings opskrifter.
| 10x Earles afbalancerede salt opløsning uden ca eller mg (EBSS uden ca eller mg) | 4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 · H2o 10 g dextrose Tilsæt vand til 1 liter, pH til 4,32 Passere gennem filteret |
| Løsning 1 | 20 mL 10x EBSS uden ca eller mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1.5 M Hepes 10 mL af 10 mL EGTA Tilsæt vand til 200 mL |
| Løsning 2 | 100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Tilsæt vand til 1 liter |
| 0,75% kollagenase opløsning | 15 mg kollagenase type 1 20 mL opløsning 2 |
| Komplet medium | 2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x penicillin-streptomycin |
Tabel 1: løsnings opskrifter.
- Få linje MTD2 mus38 til at fungere som kilde til onkogene hepatocytter.
- Anesthetize 5-ugers gamle MTD2 mus ved hjælp af 2,5% isofluran.
Bemærk: korrekt bedøvelsesmiddel vil blive kontrolleret af toe pinch-metoden. Kort sagt, ved hjælp af to fingre, giver musen tå/fod en god klemme. Hvis der ikke er nogen tilbagetræknings reaktion, dyret er dømt dybt nok til at påbegynde kirurgi. - Når tilstrækkeligt bedøvede, Placer mus i en liggende position og fastgør ekstremiteterne med tape for at give tilstrækkelig eksponering af abdominal overflade.
- Udfør en midterlinjen laparotomi indsnit ved hjælp af en saks langs længden af Linea Alba stor nok til at give en tilstrækkelig eksponering af leveren.
- Fortrænge tarmene til venstre for at give bedre eksponering af leveren og Portal Triaden.
- Dissekere over leveren for at afsløre den ringere Vena cava (IVC).
- Ligate IVC over leveren ved hjælp af en arterie klemme.
- Vender tilbage til den ringere grænse af leveren, bruge en butterfly nål (Se materialer) for at få IV adgang til portalen vene. Fix kateter i hånden.
- Derefter perfuse muse leveren ved hjælp af en injektionssprøjte ved 8,9 mL/min med 15 mL opløsning 1, 15 mL 0,75% kollagenase opløsning 2, og 15 mL opløsning 2 via kateteret.
- Høst den perfbrugte leveren ved at skære og tage tumormassen fra MTD2 mus i en 50 mL konisk rør med 10-15 mL PBS.
- Fjern PBS og vask en ekstra tid med PBS; Du må ikke centrifugeres på dette trin.
- Skær leveren i mindre stykker ved hjælp af en saks og derefter vaske igen med PBS 2x at fjerne resterende blod.
- Der tilsættes 5 mL komplet RPMI-medium til det koniske rør og kontinuerligt Haker leveren med en saks til små stykker (< 3 mm)-væv skal jævnt gå gennem en 5 mL pipette.
- Tilføj komplet RPMI til en endelig volumen på 30 mL og suspendere leveren ved hjælp af en 5 mL pipette.
- Den blandede opløsning filtreres med en 70 μm-si i et 50 mL konisk rør.
- Vask straineren flere gange med komplet RPMI og Juster den endelige volumen til 50 mL ved at tilføje yderligere RPMI medium.
- Drej hurtigt suspensionen med centrifuge til maksimalt 500 rpm; Når hastigheden accelereres til 50 x g, skal centrifugen stoppes.
- Decant supernatanten og suspendere pellets i 20 mL PBS.
- Tæl celler ved hjælp af Trypan blå udelukkelse og en hemocytometer, derefter justere celle koncentrationen til 2,5 x 106/ml for følgende celle inokulation.
Bemærk: det forventede udbytte fra 5 gram tumor væv er 80.000.000 hepatocytter med levedygtighed > 95%.
3. inokulerende hepatocytter fra MTD2 mus til leveren af vildtype C57BL/6J mus ved ISPL injektion
- Den aseptiske teknik bør anvendes i alle de procedurer, der er
- Anæstetisere CCl4-behandlede mandlige C57BL/6j mus med 2,5% isoflurane, skal musene behandles med Eye Lube for at forhindre, at øjnene tørrer ud.
- Forbered sprøjter med 200 μL hepatocytter til injektion.
- Placer musene med venstre side opad, når de er tilstrækkeligt bedøvede.
- Barberer hele venstre flanke af musene, derefter skrubbe området, vekslende mellem 70% alkohol og betadin tre gange.
- Giv 5 mg/kg carprofen subkutant før kirurgisk incision.
- Lav en 1 cm snit på venstre flanke parallelt med 13th ribben fra rygmarven ekstreme begyndende lige under rygsøjlen musklen.
- Identificer milten, derefter exteriorize det ved hjælp af stump-pegede pincet.
- Klip milten med to mellemstore titanium clips. Placer begge klip mellem den milske arterie og vene, lad rummet mellem klippene skæres senere efter inokulation.
Bemærk: målet er at isolere den ringere pol af milten for at reducere risikoen for såning. - Injicer 200 μL (500.000) af de fremstillede hepatocytter i milten ved hjælp af en 27 G nål.
- Klip den ringere gren af pedile (ringere milt pole fartøjer) med en mellemstore klip.
- Skær milten mellem de to oprindeligt placerede clips.
- Fjern den ringere pol af milten, der blev direkte injiceret med tumorceller.
- Brug 3-0 afpolyglactin 910 afbrudt suturering at lukke det indre muskellag.
- Brug steriliseret stål sår clips til at lukke det ydre hudlag.
Bemærk: stål clips foretrækkes over suturer for at undgå dyr, der tygges ud suturer, efterlader et gabende sår. - Giv 5 mg/kg carprofen subkutant efter sutur.
- Placer alle inddrive dyr på en temperaturkontrolleret varmepude og monitoren tæt indtil fuldt genvundet fra anæstesi.
- Giv mus fri adgang til vand efter operationen. Hvis musen bliver dehydreret under operationen, administreres subkutane væsker (< 1 mL).
- Fjern hud klip på 7-10 dage post-operativt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onkogene hepatocytter isoleret fra TAg-Transgene mus (figur 2) blev seedet i leveren af vilde type mus ved intra-splenisk injektion (figur 3). Den transplanterede hepatocytter succesfuldt og pålideligt voksede ortotopisk HCC tumorer (figur 4) med tumor specifikke antigen SV40 TAg (figur 5) i indstillingen af hepatisk inflammation og fibrose (figur 1).
Figur 1: skematisk til at forberede musemodel af HCC. Det eksperimentelle design til etablering af en innovativ murine model af HCC. C57BL/6J-mus behandles først med IP-injektion af CCl4 to gange ugentligt i fire uger for at inducere lever fibrose. To uger efter den sidste IP-injektion modtager de CCl4-behandlede mus hepatocytter, som er isoleret fra unge mandlige MTD2-mus via ispl-inokulation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: isolering og rensning af hepatocytter fra line MTD2 mus. (A) hepatocytter isoleret fra MTD2 mus blev udarbejdet i henhold til protokol og plettet med trypan og et blå til at detektere levedygtighed og renhed af celle isolation. Det venstre panel viser både hepatocytter (sort pil) og tumor infiltrerende lymfocytter (røde pile), der er isoleret under celle ekstraktion. Højre panel viser celle populationen resterende efter lav hastighed centrifugering, herunder hepatocytter (sort pil) og betydeligt færre tumor infiltrerende lymfocytter. Forstørrelse = 10x mål, skaleringsbar = 100 μm.B) hepatocytter, der er isoleret fra MTD2-mus, farves med trypan og et Blue-opløsning før inokulering af vildtype C57BL/6j-mus. Celle isolation er fast besluttet på at blive en succes, hvis levedygtigheden er > 95%. Døde celler vil blive plettet med trypan og et blå (røde pile), mens levedygtige celler ikke vil blive plettet (sort pil). Forstørrelse = 10x objektiv, skala bjælke = 100 μm. Grafen til højre viser resultaterne af celle isolering med > 95% af hepatocytterne er levedygtige, statistiske data kommer fra 5 forskellige observerede felt under mikroskop; fejllinjer repræsenterer +SD. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Intrasplenisk inokulering af hepatocytter i leveren af vildtype C57BL/6J mus. Det eksperimentelle design for ispl inokulering af hepatocytter at inducere HCC i C57BL/6j mus. (1) milten identificeres og er udekoriseret. (2) milten klippes med to mellemstore titanium clips. (3) tilberedte hepatocytter injiceres i den ringere pol af milten. (4) den ringere gren af pedile (ringere milt pole fartøjer) er klippet med en mellemstore klip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: progressiv tumor udvikling i C57BL/6J mus efter inokulation med MTD2-hepatocytter. (A) hepatocellulær karcinom (HCC) ortotopisk tumor model blev fastsat i henhold til protokol. Anatomiske billeder blev taget før inokulation og ved sub-sekventielle tidsforløb. (a) viser en sund lever før inokulering med MTD2 hepatocytter. (b) mus lever 3 måneder efter inokulering med tegn på grov tumor udvikling. c) 3,5 måneder efter inokulering med stigende tumorbyrde. d) 4,5 måneder efter inokulering. (e) 6 måneder efter inokulering med tegn på tumor i hele leveren. (B) tumor knuder blev høstet og vejet på de tidspunkter, der er angivet efter inokulering med MTD2 hepatocytter. Fejllinjer repræsenterer +SD. * * *P < 0,001, statistisk analyse blev udført af t-tests. C) repræsentative billeder af dværg-og MTD2-inokulerede lever sektioner. Hematoxylin og eosin (H & E) farvning skildrer pseudoglanddannelse (sorte pile). Der er nuklear fortrængning, og tumorceller er eosinofile med høje Nucleus-til-cytoplasma nøgletal (forstørret billede). Forstørrelse = 20x objektiv, skala bjælke = 50 μm. Indsættene øverst til højre forstærkes yderligere manuelt. D) Sirius rød farvning, der indikerer unormal kollagen deposition, i overensstemmelse med lever fibrose. Forstørrelse: 40x objektiv, skaleringsbar = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: specifik påvisning af SV40 T antigen-gen i tumor. (A) tumor væv og yderligere vævsprøver i hele mus blev indsamlet fra tumor-etablerede mus. Genomisk DNA blev isoleret fra væv og primere for både SV40 T AG og P53 (kontrol) blev syntetiseret til konventionel PCR. SV40 T antigen-genet blev påvist i tumorvævet, men er ikke til stede i enten det normale væv eller andet væv i musene. (B) tumor væv blev indsamlet fra tumor-bærende mus og farvet med anti-SV40 T antigen antistof. Venstre panel er en negativ kontrol fra sundt levervæv indsamlet fra naive mus. Højre panel viser signifikant SV40 T antigen farvning af tumor væv indsamlet fra tumor-bærende mus (brun farve). Forstørrelse = 40x objektiv, skaleringsbar = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denne protokol har vi etableret en pålidelig og reproducerbar murine model af HCC, der efterligner Human HCC initiering og progression. Klinisk, mange risikofaktorer successivt inducere leverskade, lever fibrose, cirrhose og den sidste fase af HCC. I vores protokol, IP injektion af CCL4 bruges til først at producere lever fibrose i vildtype mus, som gør det muligt for de efterfølgende onkogene hepatocytter til dannelse af tumorer i fastsættelsen af lever fibrose. Vi fandt, at tumordannelse forekom mest med succes i mus, der modtog hepatocyt inokulering to uger efter CCL4 behandling, sammenlignet med mus, som modtager injektioner på andre tidspunkter. Derudover fandt vi lever fibrose kan påvises op til fire måneder efter CCl4 injektion. Denne tilgang resulterer i mere end 90% af mus udvikler HCC tumorer i forhold til mus uden udsættelse for CCl4. I vores model, hepatocytter overført fra line MTD2 mus til C57BL/6J mus, trafik til leveren, hvor de bliver indarbejdet som hepatocytter, der udtrykker TAg som et vævs antigen. Isolering af hepatocytter fra MTD2 er et kritisk skridt i løbet af denne protokol. MTD2 mus lever er perfektioneret grundigt med løsning 1 og 2 for at fjerne cirkulerende røde blodlegemer i leveren helt. Den kollagenase opløsning bruges til at perfuse leveren ved den angivne koncentration og hastighed til at generere korrekt lever fordøjelse at frigive hepatocytter. Brugen af lavere koncentrationer af kollagenase er utilstrækkelig til fordøjelsen, hvilket resulterer i klumper af hepatocytter. I modsætning hertil er høje koncentrationer for barske på vævet, hvilket resulterer i en signifikant reduktion af levedygtige hepatocytter. Vi finder også, at kort centrifugering som beskrevet i vores protokol er forpligtet til at forbedre renheden af hepatocytter. Det lavere spin, vi brugte til centrifugering, kan udløse hepatocytter og efterlade leukocytter i supernatanten baseret på densitets forskel på disse to typer celler.
Det næste kritiske trin er ruten for inokulerende hepatocytter i vildtype mus. I vores pilotundersøgelser, vi udforskede forskellige måder at udføre hepatocyt inokulation. Den vellykkede ortotopiske tumorvækst i leveren ses bedst hos mus, der får intrasplenisk inokulering af onkogene hepatocytter i en dosis på en halv million celler pr. mus, sammenlignet med de mus, der modtager celler administreret via hale vene og intraperitoneal injektion ved forskellige doser. Disse fund tyder på, at den ortotopiske HCC-vækst er rute-og dosisafhængig. Malign omdannelse sker gradvist og er begrænset til den delpopulation af transplanterede hepatocytter i stedet for hele leveren parenchyma. Fortsat celle spredning resulterer i tumor knuder udvikler i hele leveren.
For HCC eller andre kræftformer at fremskridt det skal unddrage sig immunforsvaret; faktisk, undgå immun destruktion er nu betragtes som et kendetegn for kræft39. Men manglen på tumor-specifikke antigen er en kritisk barriere for at belyse de underliggende mekanismer. I vores model, TAg udtrykkes i tumorer, ikke andre organer, der fungerer som en tumor-specifikke antigen. Også, TAg har mange veldefinerede epitoper, der kan genkendes af CD8 T celler i C57BL/6J mus. Med hensyn til TAg epitop-I, har vi genereret line 416 mus, som transgenically Express T celle receptorer for denne epitop34. Målretning TAg til at undersøge tumor antigen-specifikke immunrespons giver os mulighed for at undersøge tumor immun overvågning under tumor initiering og progression, hvilket ikke er muligt ved hjælp af modeller induceret af DEN eller genetiske manipulation. Elucidating de underliggende mekanismer gør det muligt for os at identificere kritiske celler og molekyler mætnings tumor-induceret immuntolerance. Målretning af disse nøglefaktorer kan i væsentlig grad fremme vores udvikling af innovative immunotherapeutiske strategier mod HCC. Ved hjælp af denne unikke HCC model og etablerede værktøjer, vi har undersøgt de mekanismer underliggende tumor-induceret tolerance25,35 og udforsket forskellige immun-baserede antitumor immunoterapi31,32 , 36 , 37.
Sammenfattende afspejler vores etablerede murine model af HCC nogle typiske træk ved sygdomme hos mennesker. I vores tidligere offentliggjorte artikel, vi var i stand til at etablere dette som en klinisk relevant tumor model, der havde typiske funktioner i human HCC. Vi viste, at musene behandlet med CCl4 og MTD2 hepatocytter udviklet tumorer, der udtrykte HCC-associerede antigener, AFP og GPC336. Patologi fastslået, at læsioner i vores murine model er ens både makroskopisk og patologisk til humant HCC. Ved at udnytte denne pålidelige model og de udviklede værktøjer, kan vi studere denne komplekse menneskelige sygdom, herunder indsigt i mekanismer af HCC udvikling og klinisk tilgængelig behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen til at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) og NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
References
- O'Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma - United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
- Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
- Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
- Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G.
- Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
- Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
- Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J.
- Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
- Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
- Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
- Pang, T., Lam, V.
- Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
- Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
- Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
- Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
- Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
- Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
- Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
- Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
- Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
- Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
- Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
- Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
- Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
- Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
- Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
- Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
- Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
- Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
- Staveley-O'Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
- Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
- Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
- Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
- Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
- Hanahan, D., Weinber, R.
