Summary
Multi-geometrisk variabel-antall tandem-gjenta analyse (MLVA) analysen presenteres her muliggjør billig, robust og bærbar høyoppløselig genotyperingteknologi av fisk-patogene bakterien Yersinia ruckeri. Starter fra rene kulturer, analysen sysselsetter multiplex PCR og kapillær elektroforese å produsere ti-Loci MLVA profiler for nedstrøms applikasjoner.
Abstract
Yersinia ruckeri er en viktig patogen av oppdretts laksefisk over hele verden, men enkle verktøy egnet for epizootiological undersøkelser (infeksjon tracing, etc.) av denne bakterien har manglet. A multi-geometrisk variabel-nummer tandem-gjenta analyse (MLVA) analysen ble derfor utviklet som et lett tilgjengelig og entydig verktøy for høyoppløselig genotyperingteknologi av gjenopprettede isolat. For MLVA analysen presenteres her, DNA er Hentet fra kultivert Y. ruckeri prøver ved å koke bakterielle celler i vann, etterfulgt av bruk av supernatanten som mal for PCR. Primer-parene målretting ti variable-Number tandem-REPEAT (VNTR) Loci, ispedd hele Y. ruckeri Genova, fordeles likt blant 2 5-Plex PCR reaksjoner kjører under identiske sykling forhold. Forward primere er merket med ett av tre fluorescerende fargestoffer. Etter amplicon bekreftelse ved gel elektroforese, er PCR-produktene fortynnet og utsatt for kapillær elektroforese. Fra de resulterende elektroferogrammet profilene er topper som representerer hver av VNTR-Loci, størrelses kalt og ansatt for beregning av VNTR-antall i silisiummangan. Resulterende ti-sifret MLVA profiler blir så brukt til å generere minimum spenner over trær muliggjør epizootiological evaluering av klynge analyse. Den svært bærbare utgangs data, i form av numeriske MLVA profiler, kan raskt sammenlignes på tvers av laboratorier og plassert i en spatiotemporal sammenheng. Hele prosedyren fra kultivert koloni til epizootiological evaluering kan fullføres for opptil 48 Y. ruckeri isolerer innen en enkelt arbeidsdag.
Introduction
Yersinia ruckeri, en Gram-negativ bakterie og medlem av Yersiniaceae-familien, fører til yersiniose i oppdretts laksefisk over hele verden1. Det er lett diagnostisert fra infiserte fisk ved dyrking på mange typer agar medier, men inntil nylig, lite var kjent om befolkningen struktur og epizootiology av Y. ruckeri over hele verden og i ulike habitater (verts arter, etc.). Eksisterende serotyping systemer for Y. ruckeri er inkonsekvent, mangel gjensidig kompatibilitet og tilbyr lav epidemiologiske oppløsning. Noen molekylær studier på bakterien har blitt gjennomført, ansette teknikker som Multilocus sekvens typing (MLST), pulserende-Field gel elektroforese (PFGE) eller hele-Genova sekvens (WGS) analyse2,3,4 ,5. Imidlertid gir MLST ikke en tilstrekkelig høy oppløsning for rutinemessig infeksjon tracing, mens PFGE er arbeidskrevende og produserer resultater som ikke er lett bærbare på tvers av laboratorier. Mens WGS analyse ville gi en nær ultimate oppløsning, etablering og gjennomføring av slike analyser ville forutsetning tekniske-og bioinformatikk evner som ennå ikke begrenset til et relativt lite antall laboratorier.
Multi-geometriske variable-antall tandem-REPEAT analyse (MLVA) representerer en enkel og lett tilgjengelig molekylær skrive verktøyet, som tilbyr en genetisk oppløsning i noen tilfeller nesten samsvarer med WGS analyse6,7. Teknikken er basert på Gjenta tall variasjon i valgt variabel-nummer tandem-REPEAT (VNTR) Loci, som resulterer i Output data som er svært transportable, noe som gjør sammenligning av profilerte isolerer mot online databaser og på tvers av laboratorier grei. Selv om MLST forblir gullstandarden for epidemiologiske skrive av mange bakterielle patogener, et økende antall studier identifisere en betydelig høyere diskriminerende effekt av MLVA8,9,10. Flere protokoller har også blitt publisert rettet mot fisk-patogene bakterier, slik som Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida og Renibacterium salmoninarum11,12, 13 i år.
Den ti-Loci MLVA protokollen som presenteres her, som nylig dannet grunnlaget for en omfattende Y. ruckeri befolknings studie14, innebærer ekstraksjon av DNA fra agar-DYRKET kolonier, multiplex PCR og kapillær elektroforese (CE), etterfulgt av nedstrøms i silisiummangan applikasjoner. For hver undersøkt isolat, to multiplex PCRene, begge inneholder fem fluorescensmerkete merket primer parene (6FAM, NED eller VIC) hver målretting individuelle VNTR regioner, kjøres parallelt under identiske forhold. Etter verifisering av PCR-amplicons ved gel elektroforese (GE), blir PCR-produktene fortynnet før CE-analysen, og topper som representerer de respektive VNTR-Loci, er størrelse kalt fra de resulterende elektroferogrammet filene. Sammen med geometriske-spesifikke formler regnskap for mindre, sekvens-spesifikke avvik i CE trekk mønstre, er VNTR CE størrelse samtaler deretter ansatt for beregning VNTR gjenta teller som er sammensatt i ti-sifret MLVA profiler. Disse brukes som inn data for epizootiological evalueringer (f.eks. ved klynge analyse i minimum sprednings tre (MST)-diagrammer).
Protocol
Advarsel: for helheten av protokollen, er det tilrådelig å utføre alle våte-Lab prosedyrer sterilely ved bruk av laboratorie frakker, en gangs hansker og sterile reagenser og utstyr. Det er også tilrådelig å forberede PCR-reaksjoner i et separat rom (pre-PCR) som ikke brukes til PCR-forsterkning og/eller håndtering av PCR-produkter (post-PCR). Oppbevar alle reagenser som anbefalt av produsenten. Se tabell over materialer for mer informasjon om reagenser, utstyr og programvare som brukes.
1. bakteriell dyrking og ekstraksjon av genomisk DNA
- Sår ut Y. ruckeri rene kulturer på enhver passende agar type (forfatterne brukt 5% storfe blod agar) og ruge ved 22 ° c for 1-2 dager, eller 15 ° c for 3-4 dager.
- Fra hver agar plate, plukke en enkelt representant koloni med en inoculation sløyfe og overføre til 1,5 mL sentrifugerør som inneholder 50 μL av ultrapurified vann. Suspendere, Vortex kort, og ruge i 7 min på en varme blokk ved 100 ° c.
- Sentrifuger på 16 000 x g i 3 min og bruk en pipette for å nøye overføre supernatanten til et tomt 1,5 ml sentrifugerør. Fortsett til neste trinn ved å bruke supernatanten som mal-DNA eller lagre ved-20 ° c til en slik tid.
2. multiplex PCR oppsett og sykling forhold
Merk: Hver multiplex PCR-reaksjon (to per Y. ruckeri isolat) skal inneholde 12,5 μL av 2X multiplex PCR Plus Master mix, 0,1 til 0,2 μM av hvert passende primer par (tabell 1) og 3 ΜL av mal-DNA, justert til et endelig reaksjons volum på 25 μL ved tilsetning av RNase-fritt vann. Sikte på å holde lys eksponering av fluorescensmerkete merket forover-primere på et minimum (f. eks, ved å pakke sine lagring rør i aluminiumsfolie).
- For hver av disse to PCR-analysene (tabell 1), klargjør man Master mikser som beskrevet ovenfor (uten mal DNA) i henhold til antall prøver pluss en positiv og en negativ kontroll. I tillegg kan du tillate 10% overskudds volum. Vortex forberedt Master mikser forsiktig ved lav hastighet.
- Distribuer 22 μL av hver Master Mix separat i individuelle brønner på enten PCR-strimler eller-plater, avhengig av antall prøver, og tilsett 3 μL av mal i hver brønn (for henholdsvis positive og negative kontroller bruker du DNA fra en verifisert Y. ruckeri belastning og ultrapurified vann). Forsegle og sentrifuger kort.
- Kjør alle prøvene på en PCR termisk cycler med følgende program: (i) 5 min ved 95 ° c (II) 30 sykluser på 0,5 min ved 95 ° c, 1,5 min ved 60 ° c, og 1 min ved 72 ° c, og (III) 60 min ved 68 ° c, etterfulgt av avkjøling til 4 ° c i det uendelige. Programmet vil fullføre på mindre enn 3 t.
3. PCR Amplicon bekreftelse av gel elektroforese
- I henhold til produsentens anbefalinger klargjør du et volum på 1,5% (w/v) agarose gel i 1x Tris-borate-EDTA (TBE)-buffer som passer for antall PCR-reaksjoner som skal testes. Tilsett 5 μL av fluorescerende nukleinsyre syre fargestoff per 50 μL av gel løsning og bland, før støping. Bruk skuffer og kammer som passer for støping, og etterlater et passende antall brønner gratis for DNA referanse stiger.
- Etter innstilling, Senk gelen i 1x TBE-buffer i et GE-system. Bland 5 μL av PCR-produkt sammen med 2 μL laste fargestoff og Overfør til gel brønner. Tilsett 5 μL DNA-stige i tomme brønner for referanse.
- Kjør gelen på 110 V per 15 cm for ca 1 t og bruk en UV-basert gel Imaging/visualisering system for å verifisere tilstedeværelsen av flere (opptil fem) band som representerer PCR amplicons (se eksempel i figur 1). Kast gelen. Fortsett til neste trinn, eller lagre resterende PCR-produkter ved 4 ° c inntil videre behandling.
4. kapillær elektroforese oppsett og Kjørebetingelser
- Etter bekreftelse av PCR-amplicons, fortynne PCR-produkter 1:10 (v/v) i renset vann. Forsegle, mikse og sentrifuge kort.
- Når du arbeider i et avtrekksskap, klargjør du et volum av Master Mix bestående av 9 μL av formamid og 0,5 μL av standard størrelse per PCR-produkt (Tillat 10% overskudds volum). En kort stund og distribuerer 9,5 μL til brønner på en plate som passer til det tilgjengelige CE-systemet, før det legges til 0,5 μL av fortynnet PCR-produkt. Forsegle, mikse og sentrifuge kort.
Forsiktig: Håndteres med forsiktighet. Blanding formamid med vann genererer maursyre syre, som er giftig. - Ved hjelp av en PCR termisk cycler, denaturere prøvene ved 95 ° c i 3 minutter før avkjøling til 4 ° c i det uendelige. Sentrifuger kort og Legg platen på et kalibrert CE-system i henhold til produsentens anvisninger.
- Kjør fragment analyse CE bruke reagenser som passer for apparater av valget og følgende innstillinger: 60 ° c; 5 s injeksjoner ved 1,6 kV (32 V per cm); 32 min. kjøretid ved 15 kV (300 V per cm). CE fragment analyse av 24 brønner på en 24-kapillær (50 cm) vil vanligvis ta ca 50 min.
5. VNTR størrelse Calling, gjenta Count beregning og MLVA profilering
Merk: Trinn 5,1 beskriver Y. ruckeri VNTR CE størrelse ringer fra elektroferogrammet filer, ved hjelp av spesifikk programvare som er oppført i tabell over materialer. Se i programvarehåndboken for mer informasjon og feilsøking. For bruk av annenprogramvare, se egnede håndbøker.
-
Importer CE resultat filer (to per Y. ruckeri isolat). Sett analysemetode til mikrosatellittmarkør standard og velg riktig produktvalg under størrelse standard, før du trykker på analyser-knappen. Kontroller riktig identifisering av størrelses standard fragmenter gjennom redigeringsprogrammet for størrelses samsvar og korriger eventuelle synlige feilaktige allokeringer.
- Etter å ha valgt prøven (e) som skal leses, trykk på skjerm plott -knappen og trykk CTRL + A for å aktivere visning av Skalerings tabellen. Mens du er i topp panelet, holder du nede CTRL mens du klikker på de fem toppene som representerer VNTR-amplicons (bruk zoomverktøyet etter behov).
Merk: For hver av de multiplex PCR-produkter, vil elektroferogrammet vise fem topper fordelt blant de tre fargestoffer ansatt (se 5 ' fargestoff merking av fremover primere i tabell 1 og de to eksemplene i figur 2). - Trykk CTRL + G for å filtrere Skalerings tabellen, som bare viser karakteristikker for de fem markerte TOPPENE, og Registrer CE-størrelse for hvert VNTR-geometrisk (med referanse til tabell 1) for nedstrøms utligning.
- Etter å ha valgt prøven (e) som skal leses, trykk på skjerm plott -knappen og trykk CTRL + A for å aktivere visning av Skalerings tabellen. Mens du er i topp panelet, holder du nede CTRL mens du klikker på de fem toppene som representerer VNTR-amplicons (bruk zoomverktøyet etter behov).
- For å gjøre rede for partisk amplicon mobilitet mønstre under CE, beregne nøyaktig VNTR gjenta teller i henhold til formelen nedenfor, ansette VNTR CE størrelse samtaler sammen med geometriske-spesifikke variabler (se tabell 1). For effektivitet er det tilrådelig å automatisere denne prosessen (f.eks. ved å bruke en regnearkmal).
- Rund beregnet VNTR-gjentakelse teller av til nærmeste heltall og sammenkoble til ti-sifrede strenger, som hver representerer MLVA-profilen til en enkelt Y. ruckeri -isolere.
6. minimum spenner over tre klynge analyse av MLVA data
Merk: Trinn 6 beskriver opprettelsen av MST-diagrammer fra Y. ruckeri MLVA-data ved hjelp av den spesifikke programvaren som er oppført i tabell over materialer. Se i programvarehåndboken for mer informasjon og feilsøking. For bruk av annenprogramvare, se egnede håndbøker.
- Opprette en ny data bank og opt å aktivere det MLVA plugg.
- Importer Y. ruckeri MLVA profiler og metadata ved å velge tegn type data etterfulgt av import felt og tegn (ytterligere under valg avhengig av lagringsformat). Når du blir bedt om det, angir du import regler i henhold til innholdet i importfilen: i kolonnen mål type KLASSIFISERER du VNTR-gjentakelse som tegn verdi: VNTRog diverse metadata som oppføringsinformasjon: inntastingsfelt .
Merk: For sammenligning og kontekst er det også mulig å importere hele datasettet som er publisert (åpen tilgang) sammen med original papiret ved å bruke den nåværende MLVA-protokollen14. MLVA profiler og metadata på variert samling av Y. ruckeri isolat (n = 484) gransket i denne studien er tilgjengelig fra supplerende materiale (tabell S1 og S2) via følgende link: https://AEM.ASM.org/Content/84/16/e00730-18/figures-Only#fig-data-additional-files - I eksperiment type panelet åpner du VNTR -oppføringen og angir minimums-og MAKSIMUMSverdier for hvert VNTR-geometrisk til henholdsvis 0 og 100. Angi antall desimal sifre til 0 under generelle innstillinger, og velg tall under datatype. Kontroller for å vurdere fraværende verdier som null.
-
Velg importerte eksempler bestemt for MST-klynge analyse, og klikk knappen Opprett ny sammenligning (i sammenligning-panelet).
- Hvis det er ønskelig for den visuelle presentasjonen av MST-en, tilordner du prøvene til fargede grupper (f.eks. i henhold til et bestemt metadata-trekk) ved å bruke de ulike alternativene som er tilgjengelige i grupper -panelet.
Merk: Grupper kan også opprettes/endres ettertid, etterfølgende til følgende trinn. - Velg Avansert klynge analyse... og MST for kategorisk-data for å generere et MST-diagram basert på de valgte eksemplene.
- Videre endre den visuelle presentasjonen av MST som foretrukket (for eksempel ved å legge til partisjonering parametere, node/gren merking, krysskoblinger, legender, etc). Se eksempel på Figur 3.
Merk: En klynge (klonal kompleks) partisjonering terskel for ≤ 4/10 ikke-identiske VNTR-Loci, i tillegg til skjuling av gren tilkoblinger som representerer > 5/10 ikke-identiske VNTR-Loci, har tidligere vært ansatt for MST klynge analyse basert på MLVA data generert ved hjelp av denne protokollen14. Forutsatt at det nevnte datasettet med 484 Y. ruckeri MLVA-profiler ble importert, kan disse eksemplene også inkluderes for analyse av MST-klynger (som beskrevet ovenfor) for å gi en global og historisk kontekst. Dette vil f. eks forenkle identifisering av eventuelle prøver tilknyttet tidligere beskrevet klonal komplekser, samt de som representerer ennå Ubeskrevne linjene. Avhengig av tilgjengelige metadata kan det resulterende MST-diagrammet gransket på forskjellige måter, for eksempel for å oppdage eventuelle klynge mønstre som er knyttet til bestemte egenskaper (geografi, vert, tid osv.). - Hvis det er nødvendig, eksporterer du den endelige MST-filen i ønsket format ved hjelp av valget Eksporter bilde .
- Hvis det er ønskelig for den visuelle presentasjonen av MST-en, tilordner du prøvene til fargede grupper (f.eks. i henhold til et bestemt metadata-trekk) ved å bruke de ulike alternativene som er tilgjengelige i grupper -panelet.
Representative Results
Etter multiplex PCR som beskrevet her, vises et typisk GE-bilde som verifiserer tilstedeværelsen av flere amplicons fra hver PCR-reaksjon i figur 1. Nedstrøms CE fragment analyse utført på verifiserte PCR-produkter vil, for hver Y. ruckeri isolere undersøkt, resultere i to elektroferogrammet filer som brukes for størrelse kall av de respektive VNTR Loci (figur 2). Fra analyse av 484 mangfoldig Y. ruckeri isolerer, ingen overlapping i amplicon størrelsesområdet ble OBSERVERT mellom VNTR Loci merket med samme fargestoff i samme multiplex reaksjon (tabell 1)14. Hver av de Elektroforetiske toppene kan derfor være entydig identifisert etter farge.
Etter import av MLVA profiler og relevante metadata i foretrukket programvare, kan MST-diagrammer konstrueres som beskrevet for gransking av eventuelle epidemiologiske mønstre av interesse i materialet. Rådfør deg med egnede håndbøker for flere alternativer som er tilgjengelige i den respektive programvaren. Som et eksempel, Figur 3 viser sammenligning av MST av MLVA profiler for Y. ruckeri isolerer utvinnes fra fisk assosiert med fem forskjellige lakse gårder i Norge.
De konsekvente repetisjons størrelsene på de ti VNTR-Loci, samt deres in vitro-og in vivo-stabilitet, har tidligere blitt verifisert i den opprinnelige studien basert på denne protokoll14. Kort, dette ble gjort ved hjelp sanger sekvensering (gjenta størrelse), og ved MLVA skrive av flere isolerer følgende seriell passasjer (in vitro) og innenfra individuelle sykdomsutbrudd (in vivo). Videre ble Loci miljømessige stabilitet over tid undersøkt ved å skrive inn flere "hus belastninger" isolerer utvinnes over flere år fra vedvarende infiserte ferskvanns produksjonsanlegg for atlantisk laks.
Figur 1 : Gel elektroforese verifisere tilstedeværelsen av flere PCR produkter. Bildet bekrefter tilstedeværelsen av flere PCR amplicons i alle 12 baner som inneholder prøver, med den første kjørefelt representerer DNA stigen brukes. Størrelsene på utvalgte stige fragmenter har blitt indikert, som har PCR-analysen og belastningen (se tabell S1 i Gulla et al. 201814) tilknytning av hvert felt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Electropherograms viser topper som svarer til VNTR amplicons. Navnene på de forskjellige VNTR-Loci indikeres, med fargestoff etiketter (VIC = grønn; NED = svart; 6FAM = blå) i parentes. De to electropherograms (PCR-analysen 1 topp; PCR-analysen 2 nederst) kommer fra å skrive av en enkelt Y. ruckeri isolat. Orange topper (Dye LIZ) representerer størrelsen standard ansatt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Eksempel minimum som spenner over tre for epidemiologiske evalueringer. Diagrammet er basert på MLVA profiler fra Y. ruckeri isolerer utvinnes fra atlantisk laks i fem forskjellige norske gårder (1-5, se legende) opplever tilbakevendende yerisniosis utbrudd. En klar klynge tendens knyttet til gården opprinnelse kan observeres. Krysskoblinger viser alle mulige tilkoblinger som involverer ≤ 1/10 ikke-identiske VNTR-Loci (se forklaring). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Elektroferogrammet visualisere hakking og splitt topper. I dette tilfellet oppstår begge samtidig, noe som ikke alltid er tilfelle. Den lengre og høyere topp, som representerer YR1070 VNTR-geometrisk, kan lett skilles. Displayet er forstørret og viser bare blå fargestoff topper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: VNTR geometriske egenskaper. Relevante karakteristikker av de ti Y. ruckeri VNTR regionene målrettet i dagens MLVA protokollen.
Discussion
Begge multiplex PCRene presenteres her har dukket opp relativt robust i møte med dårlig mal DNA-kvalitet, men mangelen på PCR forsterkning ble likevel tidvis observert ved bruk av maler med ekstremt høye DNA-konsentrasjoner. Disse problemene ble lett løst ved å fortynne malene før PCR. Andre metoder for DNA-ekstraksjon enn den som er ansatt her kan også brukes (for eksempel kommersielle kits).
Selv om fem amplicons er forventet fra hver enkelt PCR-reaksjon, bør fem visuelt gjenkjennelige bånd ikke alltid forventes fra GE, som noen (annerledes merket) VNTR-Loci innenfor samme reaksjon har overlappende størrelses områder. Den endelige PCR forlengelses tiden på 60 min kan forkortes om nødvendig, men vil sannsynligvis føre til økt forekomst av splitt topper i påfølgende CE-electropherograms (se nedenfor). Ettersom formålet med GE-trinnet bare er for kvalitativ verifisering av PCR-amplicons, kan operasjonstiden, spenningen og/eller gel-oppskriften justeres som foretrukket. Hvis det observeres spesielt svake bånd av GE, kan det være tilrådelig å redusere fortynningsfaktoren for disse prøvene før CE.
Mens CE-protokollen som beskrives her, ble kjørt på et bestemt kommersielt kapillær elektroforese apparat (se tabell over materialer), kan forskjellige CE-systemer ha forskjellige prøve krav, noe som i sin tur vil be noen endringer i protokollen . Se håndboken for den respektive produsenten av CE-systemet for instruksjoner om egnede reagenser/utstyr, kalibrering etc. for fragment analyse. Det er også en mulighet for at de partisk amplicon mobilitets mønstrene observert under CE kan variere, relativt, på tvers av CE-systemer og/eller maskiner, som tidligere har vært dokumentert for andre MLVA protokoller15,16. Hvis det forekommer i en grad der endelige (avrundede) VNTR-repetisjons verdier blir påvirket, betyr dette at de geometriske-spesifikke variablene s og i (tabell 1), som brukes til å bestemme antall VNTR gjentas, må kalibreres på nytt. Dette innebærer lineær regresjon på tomter sammenligne nøyaktig sekvens størrelser versus CE størrelse samtaler, som beskrevet av Gulla et al. 201814.
Split topper og stammer topper, både kjente gjenstander i CE basert MLVA skrive17, kan observeres i electropherograms under størrelsen ringer (Figur 4). Mens stammer topper bør ignoreres, bør den lengre toppen konsekvent velges for nedstrøms anvendelser i tilfelle av splittet topper adskilt av et enkelt base par. Dessuten, fraværende topper indikerer mangel på bestemte VNTR Loci er sjeldne, men kan oppstå, i så fall en gjentakelse antall ' 0 ' skal tildeles. Hvis start kulturen som DNA trekkes ut fra ikke er ren (dvs. inneholder mer enn én Y. ruckeri under type), kan flere høye topper som tilsvarer ulike alleler av samme geometriske/Loci OBSERVERES etter CE. Sekundær dyrket må deretter utføres fra enkelt kolonier før ny DNA-ekstraksjon for re-typing.
Som det fremgår av protokollen, bør mal DNA for PCR som standard trekkes ut fra rene kulturer av Y. ruckeri. I noen få tilfeller, imidlertid, egg-Fluid prøver tester positiv for Y. ruckeri av QPCR (CT-verdier < 27) ble vellykket MLVA skrevet direkte, uten tidligere dyrking, ved hjelp av en økt mengde genomisk DNA (ekstrahert med kommersielle Kit) som mal. Selv om denne tilnærmingen ikke har blitt grundig testet eller bekreftet, betyr det indikere potensialet i denne MLVA analysen for undersøkelse av komplekse biologiske matriser som inneholder DNA fra en rekke ulike organismer i tillegg til Y. ruckeri.
Hele MLVA skrive prosedyren presenteres her, fra DNA-ekstraksjon til epizootiological evaluering, kan være ferdig i en enkelt arbeidsdag. Imidlertid er antall prøver undersøkt i et sublinear forhold med tiden som kreves for DNA-ekstraksjon, PCR og CE, og metoden er derfor mye mer tid effektivt når du kjører flere prøver samtidig. Dette er likevel tilfelle for de fleste Lab-baserte metoder, og som et verktøy for epidemiologiske subtyping av Y. ruckeri, kombinasjonen av høy oppløsning, enkelhet og portabilitet gjør dette MLVA analysen overlegen tidligere publiserte protokoller4 ,5. Det har også blitt brukt til å verifisere begrenset epidemiologiske relevans av Y. ruckeri serotyping14.
Gjennom en omfattende MLVA basert befolknings studie som involverer 484 Y. ruckeri isolerer utvinnes fra en rekke spatiotemporal opprinnelse og habitater (vert fisk, miljø, osv.), vår forståelse om epizootiology og befolkning strukturen av denne viktige fisken patogen ble betydelig økt14. MLVA typing aktivert tracing av kloner spres anthropogenically over flere ti år, antagelig gjennom transport av fisk, samt identifisering av lokalt begrenset stammer. Videre, mens noen klonal komplekser av bakterien klart kunne knyttes til sykdom spesielt fiske verter (regnbueørret og atlantisk laks, henholdsvis), ble andre bare utvunnet fra miljømessige kilder og/eller klinisk upåvirket fisk Prøver. Anvendelsen av metoden er således ikke bare begrenset til infeksjon tracing, da det kan også gi informasjon om potensiell relevans f. eks for vaksine utvikling, risikovurdering, og vedlikehold av nasjonale biosikkerhet. Det er for tiden i aktiv bruk ved Veterinærinstituttet som et verktøy for å undersøke Y. ruckeri diagnoser i norsk akvakultur.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Den nåværende studien ble finansiert av norsk sjømat Forskningsfond, FHF (prosjekt NOS. 901119 og 901505). Vi ønsker å takke alle bidragsytere av bakterielle isolerer og prøver brukt under metodeutvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).
