Summary
È descritto un semplice e affidabile modello animale di roditore indotto dalla dieta per la steatoepatite non alcolica (NASH), ottenuto attraverso l'alloggiamento non SPF degli animali e la somministrazione di una dieta specifica ad alto contenuto di grassi. Descriviamo l'identificazione di sottoinsiemi di cellule immunitarie epatiche e adiposo per ricapitolare le condizioni immunologiche umane esponendo i topi ai germi ambientali.
Abstract
L'obesità è associata a infiammazione cronica di basso grado e resistenza all'insulina, contribuendo ad una crescente prevalenza di malattie metaboliche croniche, come il diabete di tipo 2 e la steatoepatite non alcolica (NASH). Recenti ricerche hanno stabilito che le cellule immunitarie pro-infiammatorie infiltrano obesi tessuto adiposo ipertrofico e fegato. Data l'importanza emergente delle cellule immunitarie nel contesto dell'omeostasi metabolica, vi è la necessità critica di quantificare e caratterizzare la loro modificazione durante lo sviluppo del diabete di tipo 2 e NASH. Tuttavia, i modelli animali che inducono caratteristiche patofisiologiche tipiche della NASH umana sono scarsi.
In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per identificare i sottogruppi di cellule immunitarie isolati dal fegato e dal tessuto adiposo in un modello di topo affidabile di NASH, stabilito da topi con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) in condizioni non specifiche prive di patogeno (SPF) senza barriera per almeno sette settimane. Dimostriamo la manipolazione dei topi in condizioni non-SPF, la digestione dei tessuti e l'identificazione dei macrofagi, delle cellule Natural Killer (NK), delle cellule dendritiche, dei sottogruppi di cellule B e T mediante citometria a flusso. Sono forniti diagrammi di citometria a flusso rappresentativo da topi HFD SPF e topi non SPF. Per ottenere dati affidabili e interpretabili, l'uso di anticorpi, metodi precisi e precisi per la digestione dei tessuti e la corretta gating negli esperimenti di citometria a flusso sono elementi critici.
L'intervento per ripristinare l'esposizione fisiologica di antigene nei topi che li ospita in condizioni non-SPF e l'esposizione non specifica agli antigeni microbici potrebbe fornire uno strumento pertinente per indagare il legame tra alterazioni immunologiche, l'obesità e le correlate complicazioni a lungo termine.
Introduction
L'obesità è un disturbo multifattoriale e un importante fattore di rischio per lo sviluppo di malattie cardiache, ictus, steatoepatite non alcolica (NASH), diabete di tipo 2 (T2D) e alcuni tipi di cancro. La prevalenza dell'obesità è in rapida crescita a livello globale. Oggi, 2,1 miliardi persone — quasi il 30% della popolazione mondiale — sono obesi o sovrappeso1. La resistenza all'insulina associata all'obesità può portare a T2D, quando le cellule beta dell'isolotto pancreatica esaurite non riescono a compensare l'aumentata necessità di insulina per mantenere l'omeostasi del glucosio2.
Tessuto adiposo è composto da vari tipi di cellule tra cui adipociti, cellule endoteliali, fibroblasti e cellule immunitarie. Durante la progressione dell'obesità, i cambiamenti nel numero e nell'attività delle cellule immunitarie possono portare a un'infiammazione di basso grado del tessuto adiposo ipertrofico3,4. In particolare, è stato riscontrato che l'eccessiva assunzione di energia, accompagnata da livelli cronicamente elevati di glucosio nel sangue, trigliceridi e acidi grassi liberi, porta ad ipossia adipociti, stress del reticolo endoplasmatico, compromissione della funzione mitocondriale e secrezione di citochine potenziata, con conseguente attivazione di cellule immunitarie adiposo pro-infiammatorie5,6. La ricerca passata si è concentrata principalmente sull'immunità innata, ma più recentemente le cellule immunitarie adattative (cellule T e B) sono emerse come importanti regolatori dell'omeostasi del glucosio. Possiedono cellule infiammatorie (tra cui CD8+ t, Th1 e B) o principalmente funzioni regolatorie (comprese le cellule t (Treg) regolatorie, cellule Th2) e possono sia esacerbare che proteggere contro l'insulino-resistenza7,8 , 9. il
Inoltre, sono stati proposti diversi meccanismi per spiegare come l'obesità aumenti la steatoepatite, inclusa l'aumento della produzione di citochines da parte del tessuto adiposo10. NASH, la forma progressiva di malattia epatica grassa non alcolica e un importante onere sanitario nei paesi sviluppati, è istologicamente caratterizzata da epatociti con pallino, accumulo lipidico, fibrosi e infiammazione pericellulare e può progredire verso malattia epatica in stadio terminale o carcinoma epatocellulare. Diversi regimi (ad esempio la metionina e la dieta carente di colina11) sono noti per indurre la patologia epatica simile a Nash in modelli animali non umani, ma la maggior parte di questi approcci non ricapitolano le condizioni umane di Nash e il suo metabolismo metabolico conseguenze in quanto richiedono un gene knockout specifico, manipolazioni dietetiche non fisiologiche o mancanza di insulino-resistenza tipica della NASH umana. Inoltre, la nostra comprensione dei meccanismi di base delle malattie metaboliche è attualmente basata su esperimenti condotti con topi di laboratorio alloggiati in condizioni specifiche esenti da patogeno (SPF) standard. Tali strutture di barriera sono anormalmente igieniche e non considerano la diversità microbica che gli esseri umani devono incontrare, il che può tenere conto delle difficoltà nel processo di traduzione degli studi sugli animali agli approcci clinici12,13 , ( 14).
Per indagare i diversi sottogruppi di cellule immunitarie nel tessuto adiposo e nel fegato durante lo sviluppo di resistenza all'insulina e NASH in un modello di topo avanzato che riproduce le condizioni immunologiche umane, i topi sono stati alloggiati in singole gabbie in semi sterili condizioni senza barriere. I topi alloggiati in condizioni di antigene esposto hanno sviluppato una patologia epatica simile a NASH già dopo 15 settimane di alimentazione ad alto contenuto di grassi (HFD)13. Rispetto ai topi SPF abbinati all'età hanno sviluppato steatosi macrovesicolare, infiltrazione epatica e attivazione delle cellule immunitarie.
Questo manoscritto descrive una solida analisi della citometria a flusso per definire e contare i sottogruppi delle cellule immunitarie dal tessuto adiposo del topo e dal fegato in un modello di NASH. L'analisi della citometria a flusso consente il rilevamento simultaneo di più parametri di singole cellule in contrasto con gli approcci RT-PCR o immunoistochimica.
In sintesi, il nostro studio offre un modello di topo di HFD a breve termine per indagare lo sviluppo di insulino-resistenza e NASH e i meccanismi di base che mostra anche la fedeltà alla condizione umana.
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Protocol
Questo studio è stato effettuato in conformità con la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli istituti nazionali di sanità e della legge sul benessere degli animali sotto la supervisione del nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. I protocolli animali sono stati condotti secondo le linee guida etiche istituzionali della Charité Berlin, Germania, e sono stati approvati dal Landesamt für Gesundheit und Soziales e sono conformi alle linee guida di arrivo.
1. modello animale indotto dalla dieta di steatoepatite
- Trasferire i topi (topi C57BL/6J, maschio) in un alloggiamento non SPF all'età di 4 settimane e esporli continuamente a una vasta gamma di agenti patogeni/antigeni ambientali. Garantire l'esposizione con la manipolazione quotidiana degli animali da laboratorio in quanto gli antigeni sono distribuiti dal passaggio dell'aria in questo modo.
- Mantenere i topi (topi C57BL/6J, maschi, 12 settimane di età) in sistemi di ingabbiamento aperti con filtri convenzionali su un ciclo di luce/buio 12 h:12 h ad una temperatura di 22 ° c. Non irradiare o autoclave dieta sperimentale e biancheria da letto. Accesso struttura di alloggiamento degli animali senza maschera o hairnet. Aprire le porte tra le stanze degli animali. Non utilizzare un AirShower.
- Garantire la manipolazione quotidiana degli animali da laboratorio e cambiare le stanze regolarmente in modo che gli antigeni siano distribuiti dal passaggio dell'aria. Completano l'alloggiamento sporco con esposizione microbica giornaliera non specifica agli antigeni dalla lettiera di animali da laboratorio di mammiferi alloggiati nelle camere accanto ai topi di laboratorio.
- Misurare le proporzioni della memoria CD44-CD62L- Effettuatore cellule CD4+ e CD8+ T nel sangue e nella milza utilizzando la citometria a flusso (come descritto in refefence13).
Nota: A questo proposito abbiamo definito un aumento del 20% della memoria effettrice CD8+ cellule t da CD8+ cellule t come prova di sufficiente esposizione microbica. - Avviare HFD (60 kJ% dal grasso, 19 kJ% da proteine e 21 kJ% da carboidrati e ad libitum consumo di acqua con 6% di saccarosio contenuto con 5-settimana vecchio topi C57BL/6J topi maschi per 7-15 settimane. L'HFD deve contenere 60% kJ di grassi (come descritto sopra) al fine di indurre lo sviluppo di insulino-resistenza durante tutto il corso dell'esperimento.
Nota: La colorazione di ematossilina deve essere eseguita e le caratteristiche istologiche come il ballooning degli epatociti, i corpi di Mallory Denk, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la steatosi macrovesicolare devono essere trovati per dimostrare la patologia epatica simile a NASH (come mostrato in riferimento 13).
2. preparazione di reagenti e soluzioni
- Preparare 70% etanolo, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, senza calcio e magnesio) integrata con tampone di lisi 0,5% BSA e ACK (ammonio-cloruro-potassio).
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Tampone di colorazione
- Sciogliere 10 mL di siero di vitello fetale (FCS) in 500 mL di PBS per ottenere il 2% di PBS FCS. Posizionare il tampone di colorazione sul ghiaccio prima dell'uso.
- Conservare la soluzione in una bottiglia di plastica a 4 ° c.
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Soluzione di collagenasi per la digestione del tessuto adiposo
- Sciogliere 2,5 g di albumina sierica bovina (BSA) in 500 mL di PBS per ottenere un 0,5% di BSA/PBS.
- Sciogliere 74,5 g di CaCl2 in 10 mL di 0,5% BSA/PBS per ottenere una soluzione di CAcl2 da 10 mm.
- Aggiungere 1 mg di collagenasi di tipo II (vedere tabella dei materiali) ad ogni mL di 0,5% BSA con 10 mm di CAcl2 PBS.
- Preparare 3 mL di soluzione di digestione di collagenasi per g di campione di tessuto adiposo. Preparare una soluzione di collagenasi fresca per ogni isolamento.
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Soluzione di collagenasi per la digestione del tessuto epatico
- Sciogliere 2,5 g di BSA in 500 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per ottenere il 0,5% di HBSS BSA.
- Aggiungere 10 mL di FCS in 500 mL di 0,5% BSA/HBSS per ottenere il 2% di FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Aggiungere 0,5 mg di collagenasi di tipo IV (vedere tabella dei materiali) ad ogni ml di 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Aggiungere 0,02 mg di DNasi per mL di soluzione di collagenasi 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
- Preparare 13 mL di soluzione digeribile di collagenasi per campione di tessuto epatico.
- Preparare una soluzione di collagenasi fresca per ogni isolamento.
3. generazione di sospensioni a cellula singola
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Digestione del tessuto adiposo
- Euthanize topi attraverso l'anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Spruzzare il petto con 70% di etanolo. Fare con cautela un'incisione centrale di 5-6 cm attraverso l'tegumento e la parete addominale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e il cuore.
Nota: Non danneggiare gli organi sottostanti e tenere le punte delle forbici. - Iniettare almeno 10 mL di soluzione salina al 0,9% nell'apice del ventricolo sinistro utilizzando un ago da 26 G.
Nota: Perfusione di successo è notato da scottatura del fegato. - Aprire la cavità peritoneale con le forbici e ritagliare i tamponi di grasso perigonadici su ogni lato con forbici curve sottili. Dissect tessuti gonadica con forbici curve sottili e pesare il tessuto adiposo.
- Eseguire la dissociazione meccanica usando le forbici e tagliare il tessuto adiposo in pezzi sottili in una capsula di Petri a 4 ° c. Trasferire il tessuto adiposo a 50 mL di provette centrifughe coniche e sciacquare la capsula di Petri con 1 mL di 0,5% di BSA/PBS.
- Aggiungere 3 mL di soluzione di digestione del tessuto adiposo (come preparato al punto 2,3) per grammo di tessuto adiposo. Incubare la soluzione di tessuto adiposo a 37 ° c per 20 minuti sotto agitazione delicata (200 rpm).
- Aggiungere 5 mL di 0,5% BSA/PBS per grammo di tessuto adiposo e posizionarlo sul ghiaccio. Triturati la soluzione numerose volte con una pipetta sierologica da 10 mL e passarla attraverso un filtro (100 μm) con l'ausilio di uno stantuffo.
- Centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c.
- Rimuovere la frazione di degli adipociti galleggiante mediante pipettaggio. Risospendere il pellet cellulare (frazione vascolare stromale) in 1 mL di tampone di lisi ACK (vedere tabella dei materiali). Aggiungere 10 mL di PBS 2% FCS.
- Centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c.
- Decant surnatante e risospendere il pellet cellulare in 250 μL di PBS 2% FCS.
- Conta il numero di cellule vitali su un emocitometro usando l'esclusione blu Trypan.
- Euthanize topi attraverso l'anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Spruzzare il petto con 70% di etanolo. Fare con cautela un'incisione centrale di 5-6 cm attraverso l'tegumento e la parete addominale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e il cuore.
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Digestione del tessuto epatico
- Conservare il fegato in un tubo di centrifuga conico riempito con PBS e trasportare sul ghiaccio.
- Eseguire la dissociazione meccanica con i timbri della siringa in una capsula di Petri a 4 ° c. Mettere il tessuto epatico dissezionato in una provetta da centrifuga conica da 50 mL contenente 10 mL di soluzione di digestione del fegato calda. Sciacquare la capsula di Petri con 3 mL di soluzione di digestione del fegato.
- Incubare la soluzione di tessuto epatico a 37 ° c per 20 minuti sotto agitazione delicata (200 rpm).
- Aggiungere 20 mL di HBSS. Triturati la soluzione numerose volte con una pipetta sierologica da 10 mL e passarla attraverso un filtro (100 μm) con l'ausilio di uno stantuffo.
- Centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c. Decant il surnatante e risospendi il pellet cellulare in 20 mL di HBSS.
- Centrifugare a 30 x g per 1 minuto a temperatura ambiente per rimuovere la matrice di epatociti. Scartare il pellet cellulare.
- Centrifugare il supernatante a 500 x g per 10 min a 4 ° c. Risospendere il pellet in 10 mL di 33% di soluzione media a bassa densità di viscosità (vedere tabella dei materiali) in HBSS seguita da centrifugazione (800 x g; 30 min; temperatura ambiente; senza freno).
- Risospendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi ACK e incubare per 4 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 10 mL di HBSS.
Nota: Per scartare il supernatante aspirare il supernatante con interfase (epatociti) con molta attenzione con una pipetta di trasferimento (il più possibile senza prendere il pellet con cellule immunitarie ed eritrociti). - Passare le celle attraverso un filtro da 30 μm in una provetta da centrifuga conica da 15 mL e centrifugare a 500 x g per 10 min a 4 ° c. Decant surnatante e risospendere il pellet cellulare in 250 μL di PBS 2% FCS.
- Conta il numero di cellule vitali su un emocitometro usando l'esclusione blu Trypan.
4. colorazione superficiale
- Preparare la miscela anticorpale per le cellule T-sottogruppi (pannello 1) e le cellule immunitarie innate (pannello 2) come descritto nella tabella 1 e nella tabella 2. I volumi sono ottimizzati per un campione (100 μL) per quanto riguarda le concentrazioni anticorpali.
Nota: I linfociti e le cellule immunitarie innate presentano differenze nell'autofluorescenza e devono essere analizzati separatamente. - Utilizzare fino a 3 x 106 cellule in 100 μl in un tubo di polistirene FACS per la colorazione superficiale. Per bloccare i recettori FC aggiungere 10 μL di anticorpo anti-CD16/CD32 (diluito 1:100) e incubare per 10 min sul ghiaccio. Utilizzare un campione di controllo negativo non macchiato per regolare la dispersione laterale (SSC) e la dispersione in avanti (FSC) per determinare la posizione della popolazione di celle negative.
- Vortex e aggiungere il volume appropriato di miscela di anticorpi per il pannello 1 e il pannello 2. Aggiungere 1 μL di colorante di vitalità a ciascun campione per consentire la discriminazione in tempo reale e a cellule morte. Incubare per 20 min a 4 ° c e protetto dalla luce.
- Lavare due volte con 2 mL di 2% FCS PBS e centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° c.
- Risospendere il pellet cellulare in 300 μL di PBS del 2% e conservare a 4 ° c fino all'analisi FACS.
Nota: Prima di iniziare la misurazione passare le celle attraverso il filtro a cellule 30 μm in polistirolo FACS tubo e Vortex. La citometria a flusso è stata eseguita con cellule etichettate immagazzinate nel 2% FCS PBS a 4 ° c per 1-3 h. le cellule devono essere analizzate il prima possibile per risultati ottimizzati.
5. compensazione, acquisizione e gating della citometria a flusso
- Eseguire un campione di controllo negativo non macchiato per impostare FSC e SSC e regolare le tensioni del citometro di flusso per rilevare le popolazioni leucocitarie e distinguere tra detriti e cellule vitali. Escludere detriti e cellule morte.
Nota: La vitalità delle sospensioni cellulari dal fegato potrebbe essere inferiore alla vitalità dalle sospensioni cellulari dal tessuto adiposo perigonadica a causa di un ulteriore passaggio di separazione della densità. - Eseguire singoli campioni di controllo macchiato per la compensazione multi-colore.
Nota: Le perle di cattura degli anticorpi potrebbero anche essere utilizzate per adattarsi alla sovrapposizione spettrale se il numero di celle di una popolazione di cellule di interesse è troppo basso per compensare l'uso delle cellule. Per rilevare possibili segnali di autofluorescenza della fluorescenza delle cellule meno uno (FMO) controlli per ogni anticorpo sono raccomandati ma non sono stati applicati in questo protocollo. - Avviare la misurazione, raccogliere il numero appropriato di eventi (almeno 50.000 eventi) e registrare dati sperimentali.
- Esporta i file di dati FCS per l'analisi e imposta la strategia di gating. Cancello su CD45+ leucocititi per identificare le popolazioni cellulari successive.
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Representative Results
Il protocollo descritto consente la caratterizzazione di marcatori superficiali di cellule immunitarie innate e adattative isolate dal tessuto adiposo perigonadica murina e dal fegato in un modello di NASH indotto dalla dieta. In questo modello, NASH è stato indotto dalla somministrazione di HFD più saccarosio (6%) in acqua potabile per 7 a 15 settimane in topi topi C57BL/6J, come precedentemente riportato13. È importante sottolineare che i topi sono stati alloggiati in condizioni semi sterili e, pertanto, esposti a antigeni ambientali durante l'esperimento. I topi alimentati con HFD sono alloggiati in condizioni SPF e i topi dietetici di Chow ospitati in condizioni SPF e non-SPF sono serviti come controlli. L'alimentazione HFD ha provocato un significativo aumento di peso corporeo già dopo 7 settimane in entrambi i gruppi. Una differenza significativa nel peso corporeo è stata prima evidente alla settimana 4 (P < 0,001) ed è rimasta significativa durante le seguenti settimane sperimentali. Tuttavia, non sono state mostrate differenze significative nell'aumento di peso tra i topi SPF e non SPF dopo 7 settimane13. La frazione vascolare stromale e le cellule immunitarie dal tessuto adiposo perigonadico e i fegati di topi maschi hanno alimentato un HFD per 7 settimane sono stati isolati dalla digestione della collagenasi. Le cellule immunitarie sono state etichettate con anticorpi primari coniugati con fluoroforo e le proporzioni delle cellule T, delle cellule B, dei macrofagi, delle cellule NK, delle cellule dendritiche e dei granulociti sono state quantificate attraverso l'analisi della citometria a flusso. La gating per le sottopopolazioni delle cellule T, tra cui la discriminazione del doppilet e la colorazione della vitalità, nel grasso perigonadica murina è illustrata nella Figura 1. CD45+ leucociti sono prima gated per CD4 e CD8 e successivamente gated per CD44 e CD62L di discriminare tra ingenuo, memoria centrale, memoria Effettuatore e Effettuatore T cellule. CD44+ cellule sono stati poi ulteriormente caratterizzati con CD127, KLRG1 e PD-1. Figura 2 fornisce la strategia di gating per l'analisi di cellule B, granulociti, cellule NK, macrofagi e cellule dendritiche.
I risultati rappresentativi della colorazione extracellulare delle cellule T all'interno del fegato murino dei topi esposti ad HFD rispetto ai topi HFD SPF sono dimostrati nella Figura 3a. In effetti, una percentuale più alta di cellule t CD4+ e CD8+ può essere rilevata in topi esposti alla HFD, mentre le cellule t CD4 + e CD8+ naïve intraepatica sono risultate essere considerevolmente più basse in esposizione rispetto ai topi SPF a settimana 7 (Figura 3A).
Per convalidare questi risultati, la risposta infiammatoria epatica associata all'esposizione all'antigene è stata studiata mediante colorazione di ematossilina/eosina di sezioni epatiche di 15 settimane alimentate con topi13. La steatosi grave, incluso l'aumento di grandi goccioline lipidiche con conseguente steatosi macrovesicolare, infiammazione lobulare, ballooning epatocellulare e struttura lobulare distrutta, è stata trovata nei topi esposti ad HFD mentre solo alcuni topi SPF hanno mostrato un grasso lieve accumulo nel fegato (Figura 3B). Come riportato in Figura 3C, la percentuale di cellule NK era superiore nel tessuto adiposo perigonadico di topi esposti HFD, mentre i topi HFD SPF hanno mostrato percentuali più alte di cellule dendritiche. Non sono state riscontrate differenze significative per i macrofagi e i monociti. Complessivamente, questi risultati confermano una più grave steatosi epatica nei topi esposti all'HFD e lievi differenze nel tessuto adiposo tra topi esposti a HFD e SPF.
La tabella 1 Mostra gli anticorpi utilizzati nel pannello 1. Nella tabella 2sono illustrati gli anticorpi utilizzati nell'analisi della citometria a flusso per la colorazione extracecullar delle cellule B, dei macrofagi, delle cellule NK, delle cellule dendritiche e dei granulociti.
Figura 1 : Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso delle cellule immunitarie adiposo (pannello 1). In primo luogo, le cellule sono recintate su singlet. Quindi, i detriti vengono esclusi utilizzando l'area di dispersione in avanti (FSC-A) e l'area di dispersione laterale (SSC-A) e scegliendo la dimensione corretta. Le cellule sono ulteriormente caratterizzate dall'espressione di CD45. Le cellule vitali sono selezionate utilizzando il marcatore di cellule vive/morte che è una tintura fluorescente reattiva ammina che non è perpensata per vivere le cellule, ma perdestinata alle cellule con membrane compromesse. Le cellule t sono state divise in cellule T citotossiche (CD8+) e cellule t-Helper (CD4+) e suddivise in naïve (CD44+CD62L-), memoria centrale (CD44+CD62L+), memoria effettrice (CD44+CD62L- ) ed Effettuatore (CD44-CD62L+) cellule T. Infine, CD44+ celle sono recintate su KLRG1, CD127 e PD-1. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nell'analisi della citometria a flusso delle cellule immunitarie adiposo (pannello 2). La gating delle cellule dendritiche era basata sull'espressione CD11b e CD11c. Sono state definite le seguenti altre popolazioni: cellule B, cellule NK, macrofagi, monociti e granulociti. I dati sono stati analizzati dopo l'acquisizione con il software appropriato. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3 : Analisi di citometria a flusso rappresentativo di cellule T isolate dal tessuto adiposo perigonadica murina e dal fegato. (A) cellule T CD4+ e CD8+ di fegato murino da 7 settimane di topi HFD mantenuti sotto SPF e le condizioni esposte sono state analizzate tramite citometria a flusso. B) colorazione rappresentativa di 15 settimane di HFD SPF e di topi esposti. L'infiltrazione delle cellule immunitarie e degli epatociti Pallati (punte della freccia) illustrano NASH. C) percentuali di cellule immunitarie innate adiposo come percentuale di leucociti nei topi HFD mantenuti sotto SPF o condizioni esposte per 7 settimane. n = 6-10 topi per gruppo. La significatività è stata determinata utilizzando la misura multipla ANOVA a due vie. I dati sono rappresentati come media ± SEM. * * P < 0.01, * * * P < 0,001. Questa cifra è stata modificata da refefence13. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Tabella 1: anticorpi usati nella citometria a flusso per la colorazione extracellulare (pannello 1). La quantità di anticorpo descritto è per l'analisi di un campione.
Tabella 2: anticorpi usati nella citometria a flusso per la colorazione extracellulare (pannello 2). La quantità di anticorpo descritto è per l'analisi di un campione.
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Discussion
La steatoepatite ha una forte associazione con anomalie metaboliche come l'obesità, l'insulino-resistenza e la dislipidemia15. Studi multipli indicano che l'infiammazione del tessuto adiposo può guidare la patogenesi del diabete di tipo 2, compresi i livelli alterati di cellule del sistema immunitario innato e adattivo4,5,16,17 . Inoltre, è stato trovato che l'obesità modula l'attivazione delle vie immunitarie, che può portare a complicazioni del fegato18. C'è un crescente interesse per la caratterizzazione dei fenotipi delle cellule immunitarie nella risposta infiammatoria adiposa e epatica perché ogni sottopopolazione delle cellule immunitarie contribuisce in modo diverso allo sviluppo di insulino-resistenza e steatoepatite.
Questo metodo fornisce informazioni dettagliate su come isolare e quantificare le quantità relative di cellule immunitarie dal tessuto adiposo perigonadica e fegato. Inoltre, i metodi mostrano come mantenere i topi alimentati con HFD in condizioni non-SPF al fine di indurre la steatoepatite. Il protocollo può essere utilizzato per studiare le funzioni delle cellule immunitarie e per indagare le associazioni di cellule immunitarie specifiche tra i diversi tessuti in un ambiente microbiologicamente normalizzato.
Nel nostro studio attuale, l'alimentazione HFD di topi non-SPF ha provocato lo sviluppo di insulino-resistenza e steatoepatite, mentre i topi HFD SPF hanno sviluppato resistenza all'insulina, steatosi epatica lieve, ma non steatoepatite come determinato dall'immunoistochimica. Inoltre, gli adiposo e i sottogruppi di cellule immunitarie del fegato differivano significativamente tra i topi esposti all'HFD e quelli SPF, il che conferma la nostra comprensione del significato delle diverse condizioni abitative. In sintesi, potremmo dimostrare che l'esposizione microbica alla flora commensale potrebbe influenzare le proprietà immunologiche dei topi topi C57BL/6 drammaticamente. Lavori precedenti hanno dimostrato che la diversità e la funzione del microbioma intestinale è influenzata dall'obesità indotta dalla dieta19,20 e che la funzione di barriera intestinale e la permeabilità intestinale dipendono dalle condizioni abitative21. Miriamo ad affrontare il legame tra colonizzazione intestinale e adiposo e infiammazione del fegato in una prossima pubblicazione.
Diversi punti devono essere presi in considerazione durante la fase di pianificazione dei metodi proposti. In primo luogo, sono necessarie sospensioni a singola cellula per tutti i saggi di citometria a flusso e la vitalità delle cellule può essere influenzata dal livello di dissociazione del tessuto meccanico e dalla durata della digestione del tessuto enzimatico. Al fine di evitare la distruzione dell'epitopo anticorpale e di massimizzare la resa di cellule funzionalmente vitali, dissociate, il tipo di tessuto, l'età dell'animale, le modificazioni genetiche, le concentrazioni di enzimi, la temperatura e i tempi di incubazione devono essere presi in considerazione.
In secondo luogo, il nostro protocollo è stato ottimizzato per determinare quantitativamente diversi fenotipi di cellule immunitarie da obesi HFD alimentato topi con infiammazione del tessuto adiposo e steatoepatite. Come l'integrità del tessuto, il numero di cellule immunitarie e, quindi, la qualità della digestione dei tessuti, potrebbe essere influenzata da processi infiammatori, il protocollo e la collagenasi utilizzati dovrebbero essere ottimizzati per altri tessuti rispetto al fegato o al tessuto adiposo in esperimenti specifici relativi ai metodi di dissezione, ai tempi di incubazione o alla collagenasi utilizzata per digerire il tessuto. In terzo luogo, è importante per il protocollo che ogni giorno siano inclusi diversi gruppi sperimentali per eliminare gli effetti dovuti alla variazione giornaliera del saggio di citometria a flusso (temperatura, tempi di incubazione, ecc.).
Tuttavia, ci sono alcune importanti limitazioni del metodo descritto. Al fine di discriminare i segnali positivi e negativi per regolare correttamente le porte per identificare le cellule positive per i marcatori di superficie specifici nei campioni sperimentali, i controlli di fluorescenza meno uno (FMO) (un controllo fmocontiene tutti i fluorocromi in un pannello, ad eccezione di quello che si sta misurando) avrebbe dovuto essere utilizzato. In questo esperimento i dati potrebbero essere adeguatamente compensati e il gating era chiaro, ma si consiglia di aggiungere controlli FMO per la configurazione sperimentale, quando possibile. Inoltre, FoxP3, che deve essere macchiato intracellularmente che richiede la permeabilizzazione della membrana cellulare, avrebbe dovuto essere utilizzato per quantificare le cellule T regolatorie perché consente una definizione più accurata rispetto all'uso di CD25 e CD127 (tabella 2). Anche se la citometria a flusso consente la quantificazione di diversi marcatori di superficie simultaneamente, il loro numero è limitato a 12 per campione a causa della sovrapposizione negli spettri di emissione. Per correggere la sovrapposizione spettrale, è necessaria una compensazione a fluorescenza ad alta intensità di tempo. Per tenere conto di questo, è necessario lo sviluppo di pannelli strategici o l'uso di tecniche di citometria di massa. Inoltre, potrebbero sorgere difficoltà nell'ospitare i topi in condizioni non SPF per quanto riguarda gli orientamenti specifici in materia di alloggi per animali, ma l'attuale numero ridotto di studi sui roditori non SPF dimostra che tali studi sono possibili12,21 . Ad esempio, è possibile valutare le strutture di animali separate per i topi SPF e non SPF. Lo sviluppo di un sistema immunitario umano simile a un adulto è compromesso nei topi SPF12,21, con conseguente limitazioni per tradurre le strategie di trattamento da esperimenti animali a studi clinici.
In conclusione, forniamo un protocollo dettagliato per la caratterizzazione fenotipica di adiposa murina e cellule immunitarie epatiche utilizzando citometria di flusso in un modello animale indotto dalla dieta di NASH e insulino-resistenza. Considerando la complessa funzione e la regolazione delle cellule sia innate che adattative nel contesto dell'obesità e della disregolazione metabolica, i nostri metodi proposti dovrebbero contribuire ad approfondire la nostra comprensione dei meccanismi immunologici per bilanciare l'omeostasi metabolica e, quindi, contribuire a sviluppare terapie umane che possono ripristinare le risposte immunitarie antinfiammatorie. Nel complesso, il modello animale fornito funge da modello rapido e robusto per valutare le complicanze metaboliche associate all'obesità e può essere applicato ad altri modelli di malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo anke Giuch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte e Cornelia Heckmann per l'assistenza con le procedure sperimentali e Benjamin Tiburzy di Biolegend per commenti utili sulla strategia di gating. La JS è stata sostenuta dall'Helmholtz Grant (ICEMED). Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dall'unità di ricerca clinica del Berlin Institute of Health (BIH), il "BCRT-Grant" dal Ministero federale tedesco per l'istruzione e la ricerca e la Fondazione Einstein. K.S.-B. e H.-D.V. sono finanziati da FOR2165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 26 G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35 mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40 µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15mL | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50 mL | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
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