Uso de Microtiter Dish Radiolabeling para mediciones múltiples in Vivo de Escherichia coli (p)ppGpp seguido de cromatografía de capa fina
Summary
El crecimiento de cultivos bacterianos radiomarcados en platos de microtíteres facilita el muestreo de alto rendimiento que permite múltiples ensayos técnicos y biológicos de réplica de la abundancia de piscinas de nucleótidos, incluyendo el de (p)ppGpp. Los efectos de las transiciones de crecimiento provocadas por fuentes de estrés fisiológico, así como la recuperación del estrés pueden ser monitoreados.
Abstract
El nucleótido (p)ppGpp funciona como regulador global de bacterias en respuesta a una variedad de estrés físico y nutricional. Tiene un inicio rápido, en segundos, que conduce a la acumulación de niveles que se acercan o superan los de las agrupaciones GTP. La inversión del estrés ocasiona una rápida desaparición de (p)ppGpp, a menudo con una vida media de menos de un minuto. La presencia de (p)ppGpp resulta en alteraciones de la expresión génica celular y el metabolismo que contrarrestan los efectos dañinos del estrés. Las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas tienen diferentes mecanismos de respuesta, pero ambos dependen de la concentración de (p)ppGpp. En cualquier caso, es necesario monitorear simultáneamente muchos cultivos bacterianos radiomarcados en intervalos de tiempo que pueden variar de 10 segundos a horas durante los períodos críticos de transición de estrés. Este protocolo aborda este desafío técnico. El método aprovecha las incubadoras de antenas de microtíter controladas por temperatura y agitador que permiten el monitoreo paralelo del crecimiento (absorbancia) y el muestreo rápido de cultivos radiomarcados con fosfato uniforme para resolver y cuantificar piscinas de nucleótidos cromatografía de capa fina en PEI-celulosa. Se necesitan pequeñas cantidades de muestra para múltiples réplicas técnicas y biológicas de análisis. Este método puede evaluar cuantitativamente transiciones complejas de crecimiento, como el crecimiento diónico y las tasas de rotación rápidas (p)ppGpp.
Introduction
El (p)ppGpp segundo mensajero es un regulador global que modula la expresión de un gran número de genes, incluyendo genes para sintetizar ribosomas y aminoácidos1,2. Aunque se descubrió inicialmente en Escherichia coli3, (p)ppGpp se puede encontrar tanto en bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como en cloroplastos vegetales4,5. Para E. coli y otras bacterias Gram-negativas, (p)ppGpp interactúa directamente con ARN polimerasa en dos sitios diferentes6,7,8. En Gram positivos, (p)ppGpp inhibe la abundancia de GTP, que es sentido por CodY, una proteínade unión gta con motivos de reconocimiento de ADN específicos del gen que conducen a la regulación 9,10. (p)ppGpp se acumula en respuesta a la inanición de diferentes nutrientes y condiciones de estrés, lo que resulta en un crecimiento lento y ajustes de la expresión génica para permitir la adaptación al estrés11,12.
La cantidad neta de ppGpp acumulada refleja un equilibrio entre las actividades de sintetasa e hidrolasa. En E. coli RelA es una sintetizadora fuerte y SpoT es bifuncional, con una hidrolasa fuerte y una sintetasa débil, cada uno de los cuales podría ser regulado de manera diferente de una manera dependiente del estrés. La fuerte sintetasa RelA se activa cuando la disponibilidad de tRNA cargado con codón se une al sitio ribosomal A cuando no logra mantenerse al día con las demandas de síntesis de proteínas13,14,15. La débil SpoT (p)ppGpp sintetasa se activa mientras que la fuerte (p)ppGpp hidrolasa se inhibe en respuesta a otras condiciones de estrés y a través de otros mecanismos. En algunas condiciones, proteínas como ACP o Rsd pueden unirse a SpoT, que también cambian el equilibrio entre hidrólisis y síntesis16,17. En Gram positivos, la síntesis y la hidrólisis reflejan un equilibrio más complejo entre una sola proteína de homólogo RelA SpoT (RSH) con fuertes actividades de síntesis e hidrólisis, así como hidrolasas más pequeñas y/o síntesis12.
Los nucleótidos (p)ppGpp fueron descubiertos por primera vez como inusuales manchas etiquetadas de 32P que aparecieron en autoradiogramas de cromatogramas de capa delgada (TLC) durante una respuesta estricta inducida por la inanición de aminoácidos3. Se han revisado los protocolos de etiquetado 18. El protocolo descritoaquí (Figura 1) es una modificación de estos protocolos que permite monitorear el crecimiento de múltiples muestras en placas de microtíter. Esto facilita múltiples estimaciones biológicas y técnicas de (p)ppGpp cambios en la abundancia y fue desarrollado inicialmente para estudios de cambios diauxicos19. El etiquetado de (p)ppGpp con 32P y la detección por TLC también permite mediciones de las tasas de degradación (p)ppGpp. Se han desarrollado métodos alternativos para determinar (p)niveles de ppGpp tales como espectrometría de masas, HPLC20, quimiosensores fluorescentes21,22,y fusiones de genes GFP a promotores afectados por ppGpp23, 24. Los quimiosensores fluorescentes tienen actualmente un uso limitado debido a pequeños cambios espectrales después de la unión de ppGpp, así como problemas de distinción entre ppGpp y pppGpp21. Este método es eficiente para detectar (p)ppGpp in vitro, pero no en extractos celulares. Los métodos que implican HPLC se han mejorado20 pero requieren equipos caros y no están bien adaptados a la alta puesta a través. Por último, las fusiones GFP pueden dar una estimación de la activación o inhibición dependiente de ppGpp, pero no miden ppGpp en sí. Si bien cada uno de estos métodos alternativos son valiosos, requieren equipos costosos o un tiempo de práctica sustancial, o de lo contrario no son susceptibles a múltiples muestreos cinéticos y procesamientos posteriores. Con el método descrito aquí, se pueden aplicar 96 muestras a seis placas TLC en aproximadamente 20 min (18 muestras por placa), resueltas por el desarrollo de TLC en menos de un par de horas, con datos cuantitativos obtenidos después de varias horas o durante la noche, dependiendo del etiquetado Intensidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lograr un etiquetado casi uniforme de las células es un paso crítico para este protocolo. Por lo tanto, el uso de medios definidos, como los medios MOPS o Tris, es crucial para permitir la variación de las concentraciones de fosfato portador y la actividad específica. Los medios almacenados en búfer de fosfato, como M9 o los medios A, no se pueden utilizar. La mayoría de los medios indefinidos contienen cantidades variables de fosfato, como LB, triptona y ácidos casamino. El isótopo de fosfato 33P es u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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