Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais
Summary
Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ‘ regiões não traduzidas (3 ‘ UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são pequenas RNAs regulatórias que são reconhecidas para modular inúmeras vias de sinalização intracelular em várias doenças, incluindo cânceres. Esses pequenos RNAs regulatórios interagem principalmente com as 3 ‘ regiões não traduzidas (3 ‘ UTR) de seus RNAs de mensageiro alvo (mRNAs), resultando na inibição dos processos de decodificação de mRNAs e no aumento das degradações de mRNA alvo. Com base nos níveis de expressão e nas funções intracelulares, os miRNAs são capazes de servir como fatores regulatórios de mRNAs oncogênicas e supressoras de tumores. A identificação de genes-alvo de boa-fé de um miRNA entre centenas ou mesmo milhares de alvos computacionalmente previstos é um passo crucial para discernir os papéis e os mecanismos moleculares básicos de um miRNA de interesse. Vários programas de predição de alvo de miRNA estão disponíveis para pesquisar possíveis interações de miRNA-mRNA. No entanto, a questão mais desafiadora é como validar genes alvo diretos de um miRNA de interesse. Este protocolo descreve uma estratégia reprodutível de métodos chaves em como identificar alvos de miRNA relativos à função de um miRNA. Este protocolo apresenta um guia prático em procedimentos passo a passo para descobrir níveis de miRNA, funções e mRNAs alvo relacionados usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA , geração da curva da dose-resposta, e ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ‘ UTR de um gene, que seja necessário para a compreensão apropriada dos papéis de miRNAs individuais.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) são os pequenos RNAs regulatórios que modulam principalmente o processo de tradução e degradação de RNAs mensageiro (mRNAs), reagindo às 3 ‘ regiões não traduzidas (3 ‘ UTR) em genes alvo de boa-fé1. A expressão de miRNAs pode ser regulada por mecanismos transcricional e pós-transcricional. O desequilíbrio desses mecanismos reguladores traz níveis de expressão miRNAs descontrolados e distintos em inúmeras doenças, incluindo os cânceres2. Um único miRNA pode ter interações múltiplas com mRNAs diversos. Correspondentemente, um mRNA individual pode ser controlado por vários miRNAs. Portanto, as redes de sinalização intracelular são intrinsecamente influenciadas por miRNAs distintivamente expressas pelas quais distúrbios fisiológicos e doenças podem ser iniciados e deteriorados2,3,4 , 5. º , 6. embora a expressão alterada de miRNAs tenha sido observada em vários tipos de cânceres, os mecanismos moleculares que modulam os modos de células cancerosas em conjunto com miRNAs ainda são largamente desconhecidos.
A acumulação de evidências tem sido evidenciando que os papéis oncogênicos ou supressores de tumores de miRNAs dependem dos tipos de cânceres. Por exemplo, ao segmentar a caixa de os O3 (FOXO3), o miR-155 promove a proliferação celular, metástase e quimiorresistência do câncer colorretal7,8. Ao contrário, a limitação da invasão da pilha do glioma é induzida por miR-107 através da regulação da expressão9da proteína 2 do homólogo do entalhe do locus neurogênica (NOTCH2). A avaliação das interações de miRNA-Target em conexão com as funções de miRNA é uma parte indispensável para entender melhor como os miRNAs regulam vários processos biológicos em Estados saudáveis e doentes10. Além disso, a descoberta de alvo (s) de bona fide de miRNAs pode ainda fornecer uma estratégia aperfeiçoada para uma terapia baseada em miRNA com vários medicamentos anticancerígenos. No entanto, o principal desafio no campo dos miRNAs é a identificação de alvos diretos de miRNAs. Aqui, métodos detalhados são apresentados como abordagens experimentais reprodutíveis para a determinação do gene alvo de miRNA. O projeto experimental bem-sucedido para a identificação do alvo de miRNA envolve várias etapas e considerações (Figura 1). A comparação dos níveis de miRNA maduros nas células tumorais e nas células normais pode ser um dos procedimentos comuns para selecionar um miRNA de interesse (Figura 1a). O estudo funcional de um miRNA selecionado para detectar os efeitos de um miRNA na proliferação celular é importante para estreitar a lista dos melhores alvos potenciais candidatos de um miRNA de interesse (Figura 1b). Com base nas funções experimentalmente validadas de miRNAs, é necessária uma revisão sistemática da literatura e da base de dados em empresa com um programa de predição de alvo de miRNA para pesquisar as informações mais relevantes sobre as funções genéticas (Figura 1C). A identificação de genes alvo reais de um miRNA do interesse pode ser conseguida implementando experiências tais como o ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ‘ UTR de um gene, PCR do tempo real, e mancha ocidental (Figura 1D). O objetivo do protocolo atual é fornecer métodos abrangentes de experimentos principais, a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA, geração de curva de dose-resposta e o ensaio de luciferase juntamente com a clonagem de 3 ‘ UTR de um gene. O protocolo atual pode ser útil para uma compreensão melhor das funções de miRNAs individuais e da implicação de um miRNA na terapia de cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estratégias para a determinação de alvos de miRNA de bona fide com as funções de um miRNA de interesse são indispensáveis para a compreensão de múltiplos papéis de miRNAs. A identificação de genes alvo de miRNA pode ser uma diretriz para interpretar os eventos de sinalização celular modulados por miRNAs em uma célula. Um desvelamento de genes-alvo funcionalmente importantes de miRNAs pode fornecer o conhecimento fundamental para desenvolver uma terapia baseada em miRNA no câncer.
<p class="jove_conten…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1D1A3B03035662); e fundo de pesquisa da Universidade Hallym, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
Referências
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