We rapporteren boodschapper RNA (mRNA) electroporatie als een methode die snelle en efficiënte expressie van meerdere eiwitten in het kwartel embryo modelsysteem toestaat. Deze methode kan worden gebruikt om cellen fluorescentend te labelen en hun in vivo bewegingen op te nemen door middel van timelapse-microscopie kort na elektroporation.
We melden dat mRNA-elektroporation fluorescerende eiwitten toelaat om cellen in levende kwartel embryo’s sneller en in het algemeen te labelen dan DNA-elektroporation. De hoge transfectie-efficiëntie maakt het mogelijk om ten minste 4 verschillende Mrna’s te co-transport met ~ 87% efficiëntie. De meeste van de elektroporated Mrna’s worden afgebroken tijdens de eerste 2 h post-elektroporation, waardoor tijdgevoelige experimenten kunnen worden uitgevoerd in het zich ontwikkelende embryo. Ten slotte beschrijven we hoe u dynamische beelden van levende embryo’s elektroporated met Mrna’s die verschillende subcellulaire gerichte fluorescerende eiwitten coderen.
Elektroporation is een fysieke transfectie methode die een elektrische puls gebruikt om voorbijgaande poriën in het plasma membraan te creëren, waardoor stoffen zoals nucleïnezuren of chemicaliën in de cytosol kunnen overgaan. Elektroporation wordt veel gebruikt om DNA te leveren in bacteriën, gist, planten en zoogdiercellen1,2,3. Het wordt routinematig gebruikt om genetische ladingen in doelcellen en weefsels in te voeren binnen het ontwikkelende aviaire embryo om de genetische controle van de ontwikkeling of de migratie populaties van cellen4,5,6te bestuderen, 7. Er bestaan echter ook verschillende experimentele beperkingen met DNA-elektroporation8. DNA-elektroporation introduceert bijvoorbeeld vaak zeer variabele aantallen expressie vectoren per cel en vervolgens de Mrna’s en eiwitten die ze coderen. Deze variabiliteit kan leiden tot een aanzienlijke celcellige heterogeniteit die zowel beeldanalyse als gegevens interpretatie van9,10compliceert. Bovendien beginnen eiwitten van DNA-elektroporation slechts ~ 3 h post-elektroporation en bereiken ze niet de maximale efficiëntie in het aantal cellen en de intensiteit van de fluorescentie tot 12 uur, waarschijnlijk als gevolg van de tijd die nodig is om over te brengen in de Nucleus en volledige zowel transcriptie als vertaling in vivo11.
MRNA transfectie is daarentegen effectief gebruikt in een verscheidenheid van modelsystemen, waaronder Xenopus laevis oocyten door Microinjection12,13, herprogrammatie menselijke stamcellen door mRNA lipofectamine transfectie14 , en elektroporerende recalcitrante neurale stamcellen bij volwassen muizen15. We testten het vermogen van mRNA electroporatie om cellen efficiënt te labelen tijdens de vroege aviaire embryonale ontwikkeling met behulp van in vitro gesynthetiseerde mrna’s die verschillende fluorescerende eiwitten (fps) coderen. Voor onze studies gebruikten we de pCS2 + vector, een multifunctionele expressie vector die vaak wordt gebruikt voor het uitdrukken van eiwitten in Xenopus en zebravis embryo’s. De SP6 en T7-RNA-polymerase bevorderaar in de pCS2 + staan de synthese toe van mRNA en eiwitten uit elk gekloond gen bij gebruik in een in vitro transcriptie/vertaalsysteem.
Hier tonen we aan dat mRNA electroporatie een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (fps) in gastrulerende kwartel embryo’s mogelijk maakt. We ontwierpen en genereerden veel van de expressie vectoren die in deze studies werden gebruikt. Zo hebben we de LifeAct-eGFP Gene16 in de pCS2 + Vector17 gesubgekloond om uit te drukken van de promotor en de SP6 Promoter van CMV. Het ingebrachte gen ligt stroomafwaarts van de SP6 promoter en stroomopwaarts van de SV40 poly (A) tail18. In embryo’s co-elektroporated met mRNA en DNA, FPs gecodeerd uit in vitro getranscribeerd Mrna’s werden voor het eerst gedetecteerd binnen 20 min van electroporation, terwijl FPs van DNA-expressie vectoren werden gedetecteerd pas na 3 h. meervoudige mRNAs-codering voor nucleaire, Golgi en membraan proteïnen kunnen gelijktijdig in een embryo worden geëvacueerd, wat resulteert in een snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in individuele cellen. Ten slotte, met behulp van een in vivo fluorescentie herstel na fotobleaching (FRAP) Assay, tonen we aan dat een meerderheid van de electroporated mRNAs verval binnen 2 h. Dus, snelle initiële eiwitproductie in combinatie met een beperkte nieuwe eiwit vertaling maakt mRNA elektroporation een waardevolle techniek wanneer temporele beheersing van de uitdrukking noodzakelijk is.
In dit protocol hebben we stap voor stap instructies gegeven voor het nauwkeurig microinjecteren en elektroporeren van mRNA in de cellen van gastrulerende kwartel embryo’s. We hebben aangetoond dat in vitro gesynthetiseerde mRNA-elektroporation een snelle en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten (FPs) in gastrulerende kwartel embryo’s (Figuur 2 pt 3) mogelijk maakt. Fluorescentie van H2B-Citrien eiwit vertaald uit elektroporated Mrna’s kan worden gedetecteerd doo…
The authors have nothing to disclose.
We danken David Huss voor het nuttige inzicht in dit werk. Dit werk werd deels gesteund door de Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) en de undergrad Research Fellowship van USC Provost aan M.T., het Saban Research Institute Intramural training pre-Doctoral Award aan M.D., en de Universiteit van Southern California Undergraduate Research Associates programma Award aan R.L.
BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
1.37 M NaCl | |||
27 mM KCl | |||
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
0.1% Triton X-100 |