Быстрое и эффективное выражение нескольких белков в птичьих эмбрионах с использованием мРНК Электропорации
Summary
Мы сообщаем о электронной посыле РНК (мРНК) как метод, позволяющий быстро и эффективно выражать несколько белков в системе модели перепелиного эмбриона. Этот метод может быть использован для флуоресцентно этикетки клеток и записи их виво движений по замедленной микроскопии вскоре после электропорации.
Abstract
Мы сообщаем, что электропорация мРНК позволяет флуоресцентным белкам маркировать клетки в живых перепелиных эмбрионах быстрее и шире, чем электропорация ДНК. Высокая эффективность трансфекции позволяет со-трансфицировать по крайней мере 4 различных мРНК с эффективностью 87%. Большинство электропорированных мРНК деградируют в течение первых 2 ч после электропораации, что позволяет проводить эксперименты, чувствительные к времени, в развивающемся эмбрионе. Наконец, мы описываем, как динамически изображения живых эмбрионов электропоза, с мРНК, которые кодируют различные субклеточные целевые флуоресцентные белки.
Introduction
Электропорация является физическим методом трансфекции, который использует электрический импульс для создания переходных пор в плазменной мембране, позволяя веществам, таким как нуклеиновые кислоты или химические вещества, чтобы пройти в цитозол. Электропорация широко используется для доставки ДНК в бактерии,дрожжи, растения и клетки млекопитающих 1,2,3. Он обычно используется для введения генетических полезных нагрузок в клетки-мишени и ткани в развивающихся птичьего эмбриона для изучения генетического контроля развития или этикетки мигрирующих популяций клеток4,5,6, 7. Однако, несколько экспериментальных ограничений также существуют с электропорированием дна8. Например, электропорация ДНК часто вводит весьма переменное число векторов экспрессии на клетку, а затем мРНК и белки, которые они кодируют. Эта изменчивость может привести к значительной неоднородности клеток, что усложняет анализ изображений и интерпретацию данных9,10. Кроме того, белки от электропорации ДНК только начинают выражать 3 ч после электропораиляции и не достигают максимальной эффективности в количестве клеток и интенсивности флуоресценции до 12 ч, вероятно, из-за времени, необходимого для передачи в ядро и полной как транскрипция, так и перевод in vivo11.
В отличие от этого, трансфекция мРНК эффективно используется в различных модельных системах, включая ооциты Xenopus laevis путем микроинъекции12,13, перепрограммирование стволовых клеток человека с помощью липофекции мРНК14 , и электропопортнетных непокорных нервных стволовых клеток у взрослых мышей15. Мы проверили способность электропорации мРНК эффективно маркировать клетки во время раннего птичьего эмбрионального развития с помощью in vitro синтезированных мРНК, которые кодируют различные флуоресцентные белки (ФП). Для наших исследований мы использовали вектор pCS2, многоцелевой вектор экспрессии, который обычно используется для выражения белков в эмбрионах ксенопусов и зебры. Промоутеры SP6 и T7 РНК-полимераза в pCS2 позволяют синтезировать мРНК и белок из любого клонированного гена при использовании в системе транскрипции/перевода in vitro.
Здесь мы демонстрируем, что электропорация мРНК позволяет быстро и эффективно выражать флуоресцентные белки (ФП) в гаплодирующих перепелиных эмбрионах. Мы разработали и сгенерировали многие из векторов экспрессии, используемых в этих исследованиях. Например, мы подклонили ген LifeAct-eGFP16 в вектор pCS2,17, чтобы выразить от промоутера CMV и промоутера SP6. Вставленный ген лежит вниз по течению промоутера SP6 и вверх по течению хвоста SV40 (A)18. В эмбрионах, совместно связанных с мРНК и ДНК, ФП, закодированные из транскрибированных мРНК in vitro, были впервые обнаружены в течение 20 минут электропорации, в то время как ФП из векторов экспрессии ДНК были обнаружены только после 3 ч. Несколько мРНК, кодирующих для ядерного, Golgi, и мембранные белки могут быть электропоранговывого в эмбрион одновременно, в результате чего быстро ежемое выражение нескольких белков в отдельных клетках. Наконец, используя in vivo флуоресценции восстановления после фотоотбелевания (FRAP) асссе, мы показываем, что большинство электропопованных мРНК распада в течение 2 ч. Таким образом, быстрое первоначальное производство белка в сочетании с ограниченным новым переводом белка делает электропорацию мРНК ценной техникой, когда необходим временный контроль экспрессии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы поэтапно давали инструкции о том, как точно вводить микроинъекцию и электропорат мРНК в клетки гаструляционных перепелиных эмбрионов. Мы продемонстрировали, что в пробирке синтезированная электропорация мРНК позволяет быстро и эффективно выражать флуоресцентные …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дэвида Хасса за полезное понимание этой работы. Эта работа была частично поддержана Фондом Роуз-Хиллз Летний научно-исследовательский стипендий (2016-2018) и USC Проректор аттестации научно-исследовательского стипендий в М.Т., Сабан научно-исследовательский институт intramural Подготовки Предварительной докторской премии в доктора медицинских наук, и Университет Награда программы по исследованию студентов южной Калифорнии, присужденная R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
Referências
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
- Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
- Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
- Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
- Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
- Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
- Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
- Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
- Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Biologia do Desenvolvimento. 49, 321-337 (1976).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
- Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Biologia do Desenvolvimento. 149 (2), 327-338 (1992).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
- Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Biologia do Desenvolvimento. 233 (1), 13-21 (2001).
- Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
- Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
- Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
- Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).
