التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA
Summary
نحن نبلغ رسول RNA (mRNA) الكهربائي كوسيلة تسمح للتعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في نظام نموذج الجنين السمان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية الخلايا الفلورية وتسجيل ها في الحركات الحية عن طريق المجهر الفاصل الزمني بعد وقت قصير من الكهربائي.
Abstract
نبلغ أن الكهرباء mRNA يسمح البروتينات الفلورية لتسمية الخلايا في الأجنة السمان الحية بسرعة أكبر وعلى نطاق واسع من الكهرباء الحمض النووي. كفاءة الانف بنسبة عالية يسمح ما لا يقل عن 4 mRNAs متميزة لتكون مشتركة مع كفاءة ~ 87٪. وتتحلل معظم الMRNAs الكهربائي خلال أول 2 ساعة بعد الكهرباء، مما يسمح بإجراء تجارب حساسة للوقت في الجنين النامي. وأخيرا، نحن نصف كيفية صورة دينامية الأجنة الحية الكهربائي مع mRNAs التي ترميز مختلف البروتينات الفلورية المستهدفة دون الخلوية.
Introduction
الكهربائي هو طريقة التغوط المادي الذي يستخدم نبض كهربائي لخلق المسام العابرة في غشاء البلازما، مما يسمح لمواد مثل الأحماض النووية أو المواد الكيميائية لتمرير في السيتوسول. يستخدم على نطاق واسع الكهربائي لتسليم الحمض النووي في البكتيريا والخميرة والنباتات وخلايا الثدييات1،2،3. يتم استخدامه بشكل روتيني لإدخال الحمولات الوراثية في الخلايا والأنسجة المستهدفة داخل جنين الطيور النامية لدراسة الرقابة الوراثية على التنمية أو تسمية السكان المهاجرين من الخلايا4،5،6، 7. ومع ذلك، توجد عدة قيود تجريبية أيضا مع الكهربة الحمض النووي8. على سبيل المثال، غالباً ما يقدم الكهربة الحمض النووي أرقام متغيرة للغاية من ناقلات التعبير لكل خلية، وبالتالي mRNAs والبروتينات التي ترمز. هذا التباين يمكن أن يؤدي إلى عدم تجانس الخلية الكبيرة التي تعقدكل من تحليل الصورة وتفسير البيانات 9،10. بالإضافة إلى ذلك، البروتينات من الحمض النووي الكهربائي تبدأ فقط للتعبير عن ~ 3 ساعة بعد الكهربائي ولا تصل إلى أقصى قدر من الكفاءة في عدد الخلايا وكثافة الفلورة حتى 12 ساعة، على الأرجح بسبب الوقت اللازم لنقل إلى النواة وكاملة كل من النسخ والترجمة في الجسم الحي11.
وعلى النقيض من ذلك، تم استخدام التغوط mRNA بشكل فعال في مجموعة متنوعة من النظم النموذجية، بما في ذلك الخلايا الدهنية Xenopus laevis عن طريق الحقن المجهري12،13، إعادة برمجة الخلايا الجذعية البشرية عن طريق الانقبح lipofectamine mRNA14 ، والخلايا الجذعية العصبية المتمردة الكهربائي في الفئران الكبار15. اختبرنا قدرة الكهرباء mRNA لتسمية الخلايا بكفاءة أثناء التطور الجنيني في وقت مبكر من الطيور باستخدام mRNAs في المختبر توليفها التي ترميز البروتينات الفلورية المتميزة (FPs). لدراساتنا, استخدمنا ناقلات pCS2 + , ناقلات التعبير متعددة الأغراض التي تستخدم عادة للتعبير عن البروتينات في Xenopus وحمار وحشي الأجنة. يسمح المروجون للبوليميراز من نوع SP6 وT7 RNA في pCS2+ بتوليف الحمض النووي الريبي والبروتين من أي جين مستنسخ عند استخدامه في نظام النسخ/الترجمة في المختبر.
هنا، نثبت أن الكهربة mRNA يسمح التعبير السريع والفعال من البروتينات الفلورية (FPs) في أجنة السمان الغاز. قمنا بتصميم وإنشاء العديد من ناقلات التعبير المستخدمة في هذه الدراسات. على سبيل المثال، نحن subcloned الجينات LifeAct-eGFP16 في ناقلات pCS2 +17 للتعبير من المروج CMV والمروج SP6. الجين المدرج يكمن المصب من المروج SP6 والمنبع من SV40 بولي (A) الذيل18. في الأجنة التي تم تحويلها إلى كهرباء مشتركة مع الحمض النووي الريبي والحمض النووي، تم الكشف لأول مرة عن الملوثات العضوية الثابتة المرمزة من الـ mRNAs في المختبر في غضون 20 دقيقة من الكهربة، في حين تم الكشف عن الـ FPs من ناقلات تعبير الحمض النووي فقط بعد 3 ح. ترميز mRNAs متعددة للنووي، غولجي، و يمكن أن تكون البروتينات الغشاء الكهربائي في الجنين في وقت واحد، مما أدى إلى التعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في الخلايا الفردية. وأخيرا، باستخدام انتعاش الفلورة في الجسم الحي بعد حقن الصور (FRAP) ، ونحن نظهر أن غالبية mRNAs الكهربائي الاضمحلال في غضون 2 ساعة. وهكذا، فإن إنتاج البروتين الأولي السريع جنبا إلى جنب مع ترجمة بروتين جديدة محدودة يجعل mRNA الكهربائي تقنية قيمة عندما يكون التحكم الزمني في التعبير ضروريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، قدمنا تعليمات خطوة بخطوة حول كيفية الحقن المجهري على وجه التحديد وmRNA الكهربائي في خلايا أجنة السمان الغاز. لقد أثبتنا أن الكهربة المركبة في المختبر تسمح بالتعبير السريع والفعال عن بروتينات الفلورسنت (FPs) في أجنة السمان الغازية(الشكلان 2 و3). ويم?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ديفيد هاس على أفكاره المفيدة في هذا العمل. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة روز هيلز زمالة البحوث الصيفية (2016-2018) وزمالة البحوث تحت التخرج USC لM.T.، وجائزة التدريب الداخلي معهد سابان للبحوث ما قبل الدكتوراه إلى دكتوراه، وجامعة جائزة برنامج شركاء البحوث الجامعية في جنوب كاليفورنيا إلى R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
Referências
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
- Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
- Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
- Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
- Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
- Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
- Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
- Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
- Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Biologia do Desenvolvimento. 49, 321-337 (1976).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
- Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Biologia do Desenvolvimento. 149 (2), 327-338 (1992).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
- Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Biologia do Desenvolvimento. 233 (1), 13-21 (2001).
- Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
- Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
- Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
- Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).
