Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation
Summary
Wir berichten von der Botal-RNA-Elektroporation (mRNA) als methode, die eine schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine im Wachtel-Embryo-Modellsystem ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen fluoreszierend zu kennzeichnen und ihre In-vivo-Bewegungen durch Zeitraffermikroskopie kurz nach der Elektroporation aufzuzeichnen.
Abstract
Wir berichten, dass die mRNA-Elektroporation fluoreszierende Proteine ermöglicht, Zellen in lebenden Wachtelembryonen schneller und breiter zu kennzeichnen als DNA-Elektroporation. Die hohe Transfektionseffizienz ermöglicht es, mindestens 4 verschiedene mRNAs mit einer Effizienz von 87 % zu transfizieren. Die meisten elektroporated mRNAs werden während der ersten 2 h Nachelektroporation abgebaut, so dass zeitempfindliche Experimente am sich entwickelnden Embryo durchgeführt werden können. Schließlich beschreiben wir, wie man lebende Embryonen dynamisch mit mRNAs elektropoliert, die verschiedene subzelluläre zielgerichtete fluoreszierende Proteine kodieren.
Introduction
Elektroporation ist ein physikalisches Transfektionsverfahren, das einen elektrischen Impuls verwendet, um transiente Poren in der Plasmamembran zu erzeugen, wodurch Substanzen wie Nukleinsäuren oder Chemikalien in das Zytosol gelangen können. Elektroporation ist weit verbreitet, um DNA in Bakterien, Hefe, Pflanzen und Säugetierzellen zu liefern1,2,3. Es wird routinemäßig verwendet, um genetische Nutzlasten in Zielzellen und Gewebe innerhalb des sich entwickelnden Aviären Embryos einzuführen, um die genetische Kontrolle der Entwicklung zu untersuchen oder wandernde Populationen der Zellen4,5,6, 7. Allerdings gibt es auch bei der DNA-Elektroporation8mehrere experimentelle Einschränkungen. Zum Beispiel führt die DNA-Elektroporation oft eine sehr variable Anzahl von Expressionsvektoren pro Zelle und anschließend die von ihnen kodierenden mRNAs und Proteine ein. Diese Variabilität kann zu einer erheblichen Zell-Zell-Heterogenität führen, die sowohl die Bildanalyse als auch die Dateninterpretation9,10erschwert. Darüber hinaus beginnen Proteine aus der DNA-Elektroporation erst nach der Elektroporation 3 h auszudrücken und erreichen erst 12 h die maximale Effizienz der Zellzahl und Fluoreszenzintensität, wahrscheinlich aufgrund der Zeit, die für die Übertragung in den Kern und die vollständige Transkription und Übersetzung in vivo11.
Im Gegensatz dazu wurde die mRNA-Transfektion effektiv in einer Vielzahl von Modellsystemen eingesetzt, einschließlich Xenopus laevis Oozyten durch Mikroinjektion12,13, Umprogrammierung menschlicher Stammzellen durch mRNA Lipofectamin-Transfektion14 , und elektroporating widerspenstigen neuronalen Stammzellen bei erwachsenen Mäusen15. Wir testeten die Fähigkeit der mRNA-Elektroporation, Zellen während der frühen aviären embryonalen Entwicklung effizient zu kennzeichnen, indem wir in vitro synthetisierte mRNAs verwenden, die verschiedene fluoreszierende Proteine (FPs) kodieren. Für unsere Studien verwendeten wir den pCS2+-Vektor, einen Mehrzweckexpressionsvektor, der häufig zum Extieren von Proteinen in Xenopus- und Zebrafischembryonen verwendet wird. Die SP6- und T7-RNA-Polymerase-Promotoren im pCS2+ ermöglichen die Synthese von mRNA und Protein aus jedem geklonten Gen, wenn sie in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem verwendet werden.
Hier zeigen wir, dass die mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht. Wir haben viele der in diesen Studien verwendeten Expressionsvektoren entwickelt und generiert. Zum Beispiel haben wir das LifeAct-eGFP-Gen16 in den pCS2+ Vektor17 subkloniert, um es vom CMV-Promotor und SP6-Promoter auszudrücken. Das eingefügte Gen liegt flussabwärts des SP6-Promotors und vor dem SV40-Poly(A)-Schwanz18. Bei Embryonen, die mit mRNA und DNA kopodiert wurden, wurden FPs, die aus in vitro transkribierten mRNAs kodiert wurden, erstmals innerhalb von 20 min elektroporation nachgewiesen, während FPs aus DNA-Expressionsvektoren erst nach 3 h nachgewiesen wurden. Membranproteine können gleichzeitig zu einem Embryo elektropoiert werden, was zu einer schnellen und effizienten Expression mehrerer Proteine in einzelnen Zellen führt. Schließlich zeigen wir mit einer In-vivo-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleicharbeiten (FRAP) Assay, dass ein Großteil der elektroporated mRNAs innerhalb von 2 h zerfällt. So macht eine schnelle anfängliche Proteinproduktion in Kombination mit einer begrenzten neuen Proteintranslation die mRNA-Elektroporation zu einer wertvollen Technik, wenn eine zeitliche Kontrolle der Expression notwendig ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir Schritt für Schritt Anleitungen gegeben, wie man mRNA präzise in die Zellen von gastrulating quail embryos injizieren und elektroporate. Wir haben gezeigt, dass in vitro synthetisierte mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht (Abbildung 2 und 3). Fluoreszenz aus H2B-Citrin-Protein, das aus elektroporated mRNAs übersetzt wurde, konnte durch konfokale …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken David Huss für die hilfreichen Einblicke in diese Arbeit. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) und das USC Provost es Undergrad Research Fellowship an M.T., das Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award an M.D. und die University of Southern California Undergraduate Research Associates Program Award an R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
Referências
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
- Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
- Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
- Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
- Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
- Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
- Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
- Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
- Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Biologia do Desenvolvimento. 49, 321-337 (1976).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
- Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Biologia do Desenvolvimento. 149 (2), 327-338 (1992).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
- Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Biologia do Desenvolvimento. 233 (1), 13-21 (2001).
- Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
- Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
- Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
- Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).
