Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen
Summary
Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.
Abstract
Das kutane Melanom gilt als der aggressivste Hautkrebs. Obwohl die Risikofaktoren und großen genetischen Veränderungen weiterhin mit zunehmender Tiefe dokumentiert werden, hat sich die Inzidenzrate des kutanen Melanoms in den letzten Jahrzehnten rasant und kontinuierlich erhöht. Um wirksame Präventionsmethoden zu finden, ist es wichtig, die frühen Schritte der Melanominitiation in der Haut zu verstehen. Frühere Daten haben gezeigt, dass follikuläre Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) im erwachsenen Hautgewebe als Melanomzellen des Ursprungs wirken können, wenn sie onkogene Mutationen und genetische Veränderungen ausdrücken. Die Tumorigenese, die aus melanoma-anfälligen MCSCs entsteht, kann beim Übergang von MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand induziert werden. Dieser Übergang in melanoma-anfälligen MCSCs kann durch die Modulation des Aktivitätszustandes von Haarfollikelstammzellen oder durch extrinsische Umweltfaktoren wie Ultraviolett-B-Werte (UV-B) gefördert werden. Diese Faktoren können im Labor durch chemische Enthaarung künstlich manipuliert werden, was den Übergang von Haarfollikelstammzellen und MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand und durch UV-B-Exposition mit einem Benchtop-Licht bewirkt. Diese Methoden ermöglichen eine erfolgreiche räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanominitiation in der Murin-Srufenhaut. Daher werden diese in vivo-Modellsystemen wertvoll sein, um die frühen Schritte der Hautmelanom-Initiation zu definieren und könnten verwendet werden, um mögliche Methoden zur Tumorprävention zu testen.
Introduction
Das Melanom, die bösartige Form von melanozytischen Tumoren, ist die aggressivste Krebserkrankung in der Haut, bei dem das kälteste Melanom für dieMehrzahl der Hautkrebssterben verantwortlich ist. In den Vereinigten Staaten wird Melanom häufig diagnostiziert; Es wird prognostiziert, dass es die 5. bis 6. häufigste Krebsart unter den geschätzten neuen Krebsfällen 20182 seinwird. Darüber hinaus zeigen die Inzidenz der Hautveränderungen in den letzten Jahrzehnten zwar den Trend zur allmählichen Reduktion, doch die inkutanen Melanominzizessraten in den letzten Jahrzehnten zeigen einenkontinuierlichen und raschen Anstieg beider Geschlechter.
Um das kahreale Melanom effizienter zu bekämpfen, ist es wichtig, die frühen Ereignisse der Melanomentwicklung aus ihren Ursprungszellen klar zu verstehen, um klinisch wirksame Präventionsmethoden besser zu identifizieren. Es ist inzwischen bekannt, dass adulte Stammzellen wesentlich zur Tumorbildung beitragen können, da die zelluläre Herkunft von Krebserkrankungen in vielen verschiedenen Arten von Organen, einschließlich Hautgewebe3,4,5. In ähnlicher Weise können adulte Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) in der Murin-Sruckhaut bei aberwitziger Aktivierung der Ras/Raf und Fort-Wege 6als Melanomzellen des Ursprungs wirken. Diese onkogenen Mutationen allein sind jedoch nicht in der Lage, die Tumorbildung aus ruhigen MCSCs effizient zu induzieren. Melanozytische Tumoren entwickeln sich schließlich, wenn MCSCs beim natürlichen Haarfahren aktiv werden. In diesem Protokoll werden wir jedoch Methoden beschreiben, um die zelluläre Aktivierung von tumoranfälligen MCSCs künstlich zu induzieren und so eine genaue Kontrolle der Melanominitiation6,7zuermöglichen.
Durch die hier beschriebenen Methoden kann die räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanom-Initiation von tumoranfälligen MCSCs, die onkogene BrafV600E ausdrücken , zusammen mit dem Verlust des Pten-Ausdrucks erfolgreich durchgeführt werden, da wir Haben zuvor berichtet6. Diese Methode beinhaltet frühere Befunde, die die Aktivierung von Haarfollikel-Stammzellen durch Depilation sowie die Exposition von Murinhaut gegenüber UV-B die Aktivierung von MCSCs, die sich auf die Haarfollikel stützen, erleichtern und die Translokation dieser Zelle Untervölkerung der interfollikulärenEpidermis6,8, 9,10. Diese in vivo-Modellsystemen können wertvolle Informationen darüber liefern, wie physiologische und ökologische Veränderungen den zellulären Status von melanomafreundlichen MCSCs verändern können, was wiederum zu einer signifikanten Initiation von Melanomen in der Haut führen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hallmarkische genetische Veränderungen, die häufig bei Hautmelanomtumoren vorkommen, wurden gutbeschrieben. Die dominanteste Fahrermutation ist BrafV600E, und ein gentechnisch verändertes Mausmodell für BrafV600E-vermitteltes Melanom wurde von der Bosenberg-Gruppe14 erzeugt und im Jackson Laboratory deponiert. Anhand dieses Mausmodells hat unsere aktuelle Studie die Notwendigkeit einer zellulären Aktivierung von tumoranfälligen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Büro des stellvertretenden Verteidigungsministers für Gesundheitsfragen durch das Peer Reviewed Cancer Research Program unter der Auszeichnung W81XWH-16-1-0272 unterstützt. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch ein Saatgutstipendium des Cornell Stem Cell Program an A.C. White unterstützt. H. Moon wurde vom Cornell Center for Vertebrate Genomics Scholar Program unterstützt.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Referências
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